化妝品用化學原料體外3T3中性紅攝取光毒性試驗方法
一、范圍
本方法規定了化妝品用化學原料體外3T3中性紅攝取光毒性試驗的范圍、規范性引用文件、術語和定義、試驗原理、試驗材料與試劑、試驗步驟、結果判定標準。
本方法推薦適用于評價化妝品用化學原料的潛在光毒性。
二、規范性引用文件
下列文件中的條款通過本方法的引用而成為本方法的條款。注明日期的引用文件，其后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本方法，但是，鼓勵使用單位對修訂部分的引用進行研究，并提出意見。研究是否可使用這些文件的最新版本。未注明日期的引用文件，其最新版本適用于本方法。
經濟合作與發展組織（OECD）guidelines for the testing of chemicals: 3T3 NRU phototoxicity test. NO. 432

三、術語和定義
下列術語和定義適用于本方法。
（一）光毒性（Phototoxicity）
皮膚一次接觸化學物質后，繼而暴露于長波紫外線照射下所引發的一種皮膚毒性反應。
（二）細胞活性（cell viability）
測量某一細胞群總活性的參數（如細胞溶酶體攝取活性染料中性紅），其數值取決于測定的終點和試驗所用的設計方案，并與細胞總數和/或細胞活力相關。
（三）相對細胞活性（relative cell viability）
通過與溶劑（陰性）對照組的相關性來表達的細胞活性，對照組除了未經受試化學物質處理外，整個試驗過程與試驗組一樣（或+Irr或-Irr）。
（四）光刺激因子（photo irritation factor; PIF）
受試物分別在無光照(-Irr)和有光照(+Irr，無細胞毒性的紫外光/可見光（UV/vis）照射)條件下獲得兩組平行有效的細胞毒性濃度(IC50)，通過比較IC50的值得到的因子。
（五）半數抑制濃度（IC50）
使細胞活性下降50%的受試化學物質的濃度。
（六）平均光效應（mean photo effect; MPE）
受試物分別在無光照(-Irr)和有光照(+Irr，無細胞毒性的UV/vis照射)條件下獲得兩組濃度反應曲線，通過數學分析導出的數值。
（七）預測模型（prediction model）
將毒性試驗結果轉換為預測毒性潛力的算法。在本方法中，PIF和MPE可用于把體外3T3中性紅攝取光毒性試驗的結果轉換為對光毒性潛力的預測。

四、試驗原理
光毒性是指應用于機體的物質經暴露于光線后誘發或增強（在低劑量水平時明顯）的毒性反應，或全身應用一種物質后由皮膚光照引起的反應。中性紅是一種弱的陽離子染料，極易以非離子擴散的方式穿透細胞膜并在細胞溶酶體內聚集。某些化學物質和外界條件作用可引起細胞表面或溶酶體膜敏感性的改變導致溶酶體脆性增高等不可逆的細胞毒性變化，從而導致細胞吸收中性紅的能力下降。
本試驗方法通過測定3T3成纖維細胞經化學物質和紫外線照射聯合作用后細胞吸收中性紅的能力或細胞毒性的變化來判斷該化學物質是否具有光毒性。

五 試驗材料與試劑
（一）光源類型
選擇合適的光源必須符合的標準包括：光源發射的光波長能被受試物吸收（吸收光譜），光的劑量（在一個合理的暴露時間內能達到的劑量）能滿足已知光毒性化學物質的檢測。此外所有的波長和劑量不能有損于試驗系統，如（紅外區域）熱量散發或類似UVB波長的高細胞毒性的干擾，因此光源要求能夠穩定地釋放UVA和可見光波長。
由于所有的太陽光模擬器都發射出相當數量的UVB，應經過適當的過濾使UVB＜0.1J/cm2。透過96孔組織培養板蓋的光強度建議為1.7mW/cm2光強度（即5J/cm2）劑量。
（二）細胞株
選用永生化小鼠成纖維細胞系—Balb/c 3T3成纖維細胞。要求細胞來源必須是具有公信力的機構且能確保細胞品質穩定。
由于細胞對UVA的敏感性隨傳代數的增加可能增高，建議用于試驗的Balb/c 3T3成纖維細胞傳代次數更好少于100次。
測試單位若自行培養細胞株，則須定期檢測細胞株對UV光的敏感性，并確保無支原體污染。
（三）培養基
采用DMEM培養基、胎牛血清或小牛血清（10%）、谷氨酰胺（4mmol/L）、抗生素（青霉素和鏈霉素，濃度分別為100IU和100μg/mL），在36.5℃—37.5℃, 5%—7.5%CO2條件下培養。
（四）溶劑的選擇
在測定前，應首先評價受試物的溶解度，以選擇更佳溶劑體系。溶劑必須不與受試物發生化學反應，不影響細胞活性。
能溶于水且濃度達1000μg/mL的受試物可溶于預先加溫（37℃）和滅菌的磷酸鹽緩沖液（EBSS或PBS）。水中溶解度有限的受試物（＜1000μg/mL）可用二甲基亞砜（DMSO）或乙醇（ETOH）等溶劑溶解。使用DMSO或ETOH作為溶劑時，其終濃度不得超過總體積的1%（v/v），陰性對照組和受試物組溶劑的體積比例應相同。
（五）受試物的配制
受試物必須在使用前新鮮配制。建議所有的化學物質操作和細胞處理初期都應避免受試物在光激活或光降解的光線條件下進行。
每次實驗應設空白對照、溶劑對照和陽性對照（推薦使用氯丙嗪）。加樣示意圖見附錄B。
（六）受試物劑量的設置
需通過預實驗確定有光照和無光照條件下受試物的濃度范圍。用溶劑將受試物原液使用同一常數稀釋因子（如 ＝3.16）稀釋成8個濃度，相關濃度范圍應包括從更大細胞毒性至幾乎無細胞毒性濃度（細胞存活率在20%—的范圍）。
如果預實驗結果表明在濃度等于1000μg/mL時仍未出現細胞毒性，則建議更高濃度為1000μg/mL；若出現細胞毒性的濃度低于1000μg/mL時，有細胞毒性的濃度少于三種，則需要進行重復試驗或使用更小的稀釋因子，直至出現有細胞毒性的濃度至少三種。如果根據受試物的溶解度，更高濃度不能達到1000μg/mL，則以更大溶解度時的濃度作為更高濃度，避免受試物在任何濃度出現沉淀。
如果在無光照條件下(-Irr)受試物在更高濃度時仍然不具有細胞毒性，而在有光照條件下(+Irr)出現強烈細胞毒性，則在-Irr試驗和+Irr試驗中可采用不同的試驗濃度。
（七）中性紅（Neutral Red，NR）
化學名為3-氨基一7一二甲氨基一2一甲基吩嗪鹽酸鹽(3-amino-7-dime-2-thylamino-2-methylphenazine hydrochloride)，CAS編號:553-24-2；或藥品標準物質，編號：100460。
（八）中性紅溶液
1．中性紅原液。稱取0.4g中性紅染料，溶于100mL蒸餾水（室溫條件下可保存2個月）
2．中性紅使用液。在79mL DMEM培養液中加入1mL中性紅原液，即為使用液。中性紅終濃度為50μg/mL。
（九）中性紅解吸附溶液
將蒸餾水、乙醇、乙酸按49:50:1比例配制（現用現配，儲存不超過1小時）。

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