概念

細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主性、有序性的死亡，他涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等作用，具有生理性和選擇性的。

生理學(xué)意義

細胞凋亡對胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生、組織內(nèi)細胞群的穩(wěn)定、機體的防疫和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時引起的細胞損傷和老化、腫瘤的發(fā)生進展起著重要作用，并且有著潛在的治療意義。

概念

細胞壞死是極端的物理、化學(xué)因素或嚴(yán)重的病理性刺激引起的細胞損傷和死亡，是非正常死亡。

長期以來細胞壞死被認為是因病理而產(chǎn)生的被動死亡，但是近期的研究表明，細胞壞死可能是細胞“程序性死亡”的另一種形式，具有包括引發(fā)炎癥反應(yīng)在內(nèi)的重要生理功能。當(dāng)細胞凋亡不能正常發(fā)生而細胞必須死亡時，壞死作為凋亡的“替補”方式被采用。

細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹常用的形態(tài)學(xué)檢測方法。

1.光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

凋亡細胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，有時可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在，凋亡細胞與周圍細胞分離，不引起炎癥反應(yīng)。

本方法簡便易行，但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標(biāo)，具有較強的主觀性，重復(fù)性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標(biāo)之一。

1）未染色細胞：

凋亡細胞的體積變小、變形，全面皺縮，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體，凋亡小體為數(shù)個圓形小體圍繞在細胞周圍。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

2）染色細胞：

姬姆薩（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常細胞核色澤均一；凋亡細胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)；壞死細胞染色淺或沒染上顏色。   

蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失。

2.熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細胞凋亡的進展情況。

常用的DNA特異性染料有： Hoechst 33342， Hoechst 33258，DAPI。三種染料與DNA 的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。  DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。  

PI和Hoechst33342雙標(biāo)：
PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但DAPI不能通過正常細胞膜，Hoechst則為膜通透性熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。

正常細胞和中早期調(diào)亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故PI著色為壞死細胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細胞。  

凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：
Ⅰ 期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；
Ⅱ a期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；
Ⅱ b期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

3.電子顯微鏡

雖然光學(xué)顯微鏡下可以看見胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態(tài)學(xué)變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時期的變化。電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡最經(jīng)典、最可靠的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。

檢測方法：

透射電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。

結(jié)果評判: 

可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。

缺點：

1）只能定性,不能定量;

2）標(biāo)本處理過程復(fù)雜,設(shè)備相對昂貴,對檢查者的技術(shù)水平要求較高,不適于大批標(biāo)本檢測;

3）在組織切片上進行電鏡觀察時,有時凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別,因為兩種情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時進行熒光染色,可彌補電鏡檢查的不足。

4.流式細胞技術(shù)

流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時行的。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標(biāo)，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結(jié)合起來才能準(zhǔn)確地辨認凋亡細胞。

細胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。

細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果直觀,至今仍是判定細胞是否發(fā)生凋亡的金標(biāo)準(zhǔn),但觀察凋亡細胞的形態(tài)特征耗時費力,不適于大量凋亡樣本的檢測。

Hoechst 染料
最初由 Hoechst AG公司發(fā)明。這是一家德國公司，創(chuàng)建于1863年，后來經(jīng)過數(shù)次合并，變成了Sanofi-Aventis（賽諾菲）集團的子公司。它們所有的試劑都以數(shù)字編號命名，也就是說Hoechst 33342是該公司合成的的第33342種化合物。類似的染料一共有三種：Hoechst 33258, Hoechst 33342, 和 Hoechst 34580。33342和33258最常用，激發(fā)/發(fā)射光譜也比較接近。

三種染料都可在LUYOR-3410高強度紫外線燈發(fā)出的350nm左右的紫外光激發(fā)。都在461nm處發(fā)出藍靛色熒光。未被結(jié)合的染料更大發(fā)射光在510到540nm之間。可被氙-氬燈或水銀-氬燈或紫外線燈等激發(fā)光源激發(fā)。激發(fā)光和發(fā)射光之間的斯托克斯位移巨大，故可用于多染料多顏色熒光染色。Hoechst染料的熒光強度隨著溶液pH升高而增強。

Hoechst染料溶于水和有機溶劑，如二甲基甲酰胺或二甲基亞砜。濃度可高達10mg/mL.水溶液可在4 °C避光保存至少6個月。長期儲存于≤-20 °C。Hoechst與DNA雙鏈中的小溝（minor groove）結(jié)合，更傾向于富含A/T（腺嘌呤/胸腺嘧啶）的DNA鏈。雖然說它能與所有的核酸結(jié)合，但是富含A/T的雙鏈DNA使熒光強度顯著增強。Hoechst可穿過細胞膜，可結(jié)合于活細胞或固定過的細胞。因此可用于活細胞標(biāo)記，Hoechst能與DNA結(jié)合，干擾DNA復(fù)制和細胞分裂，因此有致畸和致癌危險。使用和廢棄需謹(jǐn)慎。

Hoechst 33342，也稱bisBenzimide H 33342或HOE 33342。分子式為C27H28N6O·3HCl·3H2O，分子量為615.99，CAS Number 23491-52-3。 Hoechst 33342是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低。Hoechst 33342染色常用于細胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。Hoechst 33342也常用于普通的細胞核染色，或常規(guī)的DNA染色。Hoechst 33342的更大激發(fā)波長為346nm，更大發(fā)射波長為460nm；Hoechst 33342和雙鏈DNA結(jié)合后，更大激發(fā)波長為350nm，更大發(fā)射波長為461nm。Hoechst 33342溶于水，溶解度可達20mg/ml。用于細胞核染色時，推薦的Hoechst 33342工作濃度為0.5-10μg/ml。Hoechst 33342對人體有害，請注意適當(dāng)防護。熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測。 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

DAPI染料：

DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測。因為DAPI可以透過完整的細胞膜，它可以用于活細胞和固定細胞的染色。
當(dāng)DAPI與雙股DNA結(jié)合時,在熒光顯微鏡的紫外光源照射觀察下，DAPI染劑在358nm(紫外線)處有一個更大吸收峰，并在461nm(藍)處有一個更大發(fā)射峰，其發(fā)射光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色，因此在熒光顯微技術(shù)中DAPI被紫外線照亮且被藍或青色濾鏡檢出。DAPI也可以和RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強度不及與DNA結(jié)合的結(jié)果，其發(fā)射光的波長范圍約在400nm左右。
DAPI可用于固定細胞染色，但是因為活細胞染色對DAPI濃度有嚴(yán)格要求，它很少被用于活細胞染色。DAPI能快速進入活細胞中與DNA結(jié)合，因此DAPI對生物體而言，也被視為一種毒性物質(zhì)與致癌物。然而在MSDS中它被標(biāo)記為無毒。盡管DAPI沒有顯現(xiàn)出對E.coli的誘變性，它在機器制造商提供的信息上被認為是一種DNA誘變劑。由于DAPI可以摻入DNA螺旋中，它很有可能有底層的DNA誘變性，因此應(yīng)小心配置和使用DAPI。