轉基因斑馬魚在抗骨質疏松化學篩選中的應用

摘要：斑馬魚最近被證明是研究包括骨質疏松癥在內的骨骼疾病的理想模型。糖皮質激素聯合化學染色可誘導斑馬魚骨質疏松模型，反映骨礦化程度。然而，這種方法是不穩定的。在這里，我們開發了一種新的方法來直接評估骨質量和密度。

方法：我們利用轉基因斑馬魚TG（ola.sp7:nlsGFP）的骨骼，通過測量增強型綠色熒光蛋白（eGFP）的面積和積分光密度（IOD）來評估骨質量和密度。該方法與傳統的化學染色方法進行了進一步的比較，顯示了骨礦化。此外，通過定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（qrt-PCR）分析與斑馬魚骨質疏松癥相關的基因。

簡介：骨質疏松癥（OP）是一種退行性骨疾病，其特征是骨質量減少、骨微結構退化和骨折風險增加。OP的發病機制與骨代謝不平衡有關，包括破骨細胞和成骨細胞分別調節的對骨形成和骨吸收過程的破壞。當骨形成率低于骨吸收率時，OP起作用。治療OP的藥物包括骨吸收抑制劑和骨形成增強劑。骨吸收抑制劑是更大的藥物類別，包括雙磷酸鹽、激素替代療法（HRT）、選擇性雌激素受體調節劑（SERMS）、降鈣素和RANK配體抑制劑。這些治療通過抑制骨吸收來增加骨密度（BMD）。骨形成增強劑直接刺激骨形成，促進成骨細胞生成膠原和骨基質。許多中藥或化合物在這些過程、體外研究和活體大鼠中都有一定的療效，包括所謂的六味地黃、淫羊霍、丹參。疾病模型對藥物的研究和開發非常重要。然而，細胞模型過于簡單化，不能準確反映整體生理學，也不能提供體內藥物代謝的大量信息。小鼠等動物模型的成本和時間劣勢限制了其在高通量篩選中的應用。相比之下，斑馬魚有幾個優勢，包括它們的快速發展和小，透明的身體。此外，斑馬魚和哺乳動物之間的發育信號通路和相關基因高度保守。脊椎動物的骨骼發育機制在進化上是保守的。與成骨細胞發育相關的主要途徑包括Wnt/β-連環蛋白、TGF-β和Hedgehog信號。與哺乳動物大體相似，低等脊椎動物的骨形成也具有由一系列轉錄因子和激素控制的軟骨內和膜內骨化。參與斑馬魚骨形成的關鍵調節因子包括與人類骨形成調節因子同源的Osterix、Runx2a/b、Col10a1和骨連素。總的來說，這些常見的發育特征為利用斑馬魚作為成熟骨骼疾病的研究模型提供了理論依據。利用組織特異性啟動子下游的報告基因的轉基因技術可用于在特定器官中產生熒光。這項技術已被用于斑馬魚的分子水平上的基因功能研究以及藥物篩選。表達增強綠色熒光蛋白（eGFP）的轉基因斑馬魚TG（ola.sp7:nlsGFP）已經被研究者用來研究軸向骨骼的發育。接受各種糖皮質激素治療的患者有時會出現OP副作用。在大多數脊椎動物中，包括哺乳動物，糖皮質激素系統是高度保守的。同樣的癥狀也可以在小鼠身上引起。糖皮質激素也被用于斑馬魚，以引起類似OP的癥狀，并建立一個OP模型。用槲皮素和茜素紅進行化學染色是骨研究中常用的方法。用能與鈣離子螯合的茜素紅染色是斑馬魚骨礦化最常用的可視化方法。但是，這種方法有缺點，包括繁瑣的技術程序（需要染色和使用多種試劑）、耗時（漫長的染色和漂白過程）、不穩定的染料標記（茜素紅并不總是能夠按要求在魚體內傳播）。在本研究中，我們試圖建立一個糖皮質激素誘導的OP（GIOP）模型，并利用骨轉基因斑馬魚TG（ola.sp7:nlsGFP）建立其評估方案。測量EGFP信號面積和積分光密度（IOD），分別反映骨礦化面積和骨密度。該方法具有方便、、穩定等優點，為抗OP藥物的高通量篩選提供了強有力的工具。

斑馬魚養殖：胚胎和幼蟲在28.5°C下，胚胎水的（5 mM Nacl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4）培養箱中培養。轉基因斑馬魚：如前所述，利用Tol2轉座子系統產生TG（ola.sp7:nlsGFP）轉基因斑馬魚。Schulte-Merker實驗室提供pDestTol2cG2-osterix-nlseGFP-PA質粒。.通過將其與野生型斑馬魚雜交并篩選表達EGFP的F1代胚胎來鑒定。本研究在同一組實驗中使用了表達強EGFP的同一對成魚的純合子胚胎。

誘導斑馬魚骨質疏松模型：野生型或轉基因幼蟲在受精后4天（DPF）在12孔培養板中培養。在胚胎水中加入N-苯基硫脲以防止色素沉淀。為了建立GIOP模型，將胚胎暴露于5、10和20μm濃度的地塞米松中，以選擇更佳有效濃度。在挽救實驗中，以FE，純度>90%提取的1.0、0.5和0.1μg/ml的黃酮類化合物與10μN DEX混合，選擇更佳有效濃度。以DMSO（1:1000）和純胚胎水為對照組。每天（使用DEX和/或鐵）更新一半體積的胚胎水。所有試驗在第五天結束，采集8條DPF魚進行骨礦化分析。每組18個胚胎。

qRT‐PCR：每組共取15條8 dpf的魚qu進行qrt-PCR分析。用 Trizol 分離總RNA，用DNA酶I處理。根據制造商的說明，使用SYBR綠色實時PCR主混合物合成cDNA時需要1000ng RNA.。將所得cDNA在DEPC處理水中稀釋1:10進行進一步實驗。qrt-PCR反應的總體積為20μl，包含10μl 2×sybr綠色實時PCR主混合物、5μl稀釋cDNA、0.8μl引物和DEPC處理水。本實驗所用的引物為：osterix‐Fw AAGAAACCTGTCCACAGCTG; osterix‐Re GAGGCTTTACCGTACACCTT; osteocalcin‐Fw TGGCCTCTATCATCATGAGACAGA; osteocalcin‐Re CTCTCGAGCTGAAATGGAGTCA; eGFP‐Fw GAAGAACGGCATCAAGGTG, eGFP‐Re ACTGGGTGCTCAGGTAGTGG; osteopontin‐Fw CGCTCAGCAAGCAGTTCAGA; osteopontin‐Re AGAATAGGAGGTGGCCGTTGA;tracp‐Fw CGTCCACTGACCACAGGAAGA,tracp‐Re AAGGATCCTGACGTCTGATTGA; β‐actin‐Fw CAACAGGGAAAAGATGACACAGAT; and β‐actin‐Re CAGCCTGGATGGCAACGT.

骨礦化的成像與評價：斑馬魚幼蟲固定在4%多聚甲醛（PFA）磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如前所述，斑馬魚幼蟲用茜素紅染色。用M205-FA立體顯微鏡對胚胎進行植入和成像。每個成像過程的增益、飽和度、曝光和照明水平都是相同的。用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）對轉基因斑馬魚TG（ola.sp7:nlsGFP）進行三維重建。在所有魚群的所有成像過程中，LSCM成像參數設置相同。針孔設置為1 AU，數字增益設置為1.0；主增益和數字偏移均設置為更低，以避免過度曝光。Z疊層和內部深度設置采用了優化的剖切深度。根據三維重建圖像評估骨礦化，并使用Image‐Pro軟件進行量化。在密度和IOD的測量過程中，滴管工具被用來反復地選擇感興趣的區域（ROI），直到所有的ROI都被選中。對于野生型魚類，如前所述測量茜素紅染色區域。對于轉基因魚，熒光圖像首先被反轉為灰度圖像。然后，用與茜素紅染色胚胎相同的方法測量熒光區和IOD，分別代表礦化程度和BMD。在計算信號強度時，采用“測量數據”和“統計”函數對IOD結果進行t檢驗。每組18個胚胎。

結果：
TG（ola.sp7:nlsGFP）斑馬魚中DEX誘導的骨質疏松樣癥狀：為了產生皮質骨轉基因斑馬魚，將pdesttol2c2-Osterix-nlseGFP-pa載體注射到AB斑馬魚胚胎中。在TG（ola.sp7:nlsGFP）斑馬魚的一系列發育階段研究了標記成骨細胞的eGFP的表達模式。最初在1 DPF胚胎的頭部和尾部區域檢測到EGFP。在8 dpf時，在唇裂（CT）、蓋層、下頜骨（MD）和鰓裂（BR）中可以清楚地看到eGFP。從30到42 dpf，eGFP強烈標記了頭側骨骼、脊柱、鰭、尾和鱗片。頭骨發育在4到8 dpf之間。在此期間，頭骨的結構和形態沒有發生明顯的變化。在這些發育階段，骨質量和骨密度均無明顯變化，分別反映在eGFP熒光區和IOD中。因此，本研究采用4～8dpf的斑馬魚幼蟲。茜素紅與鈣離子螯合，標記礦化骨，是研究骨礦化最常用的方法。在比較這兩種方法的早期骨結構時，有明顯的差異，特別是在前脊索區，其用茜素紅染色清晰，但在8 dpf時仍無標記。為了誘發OP樣癥狀，對4 DPF斑馬魚幼蟲給予不同濃度的DEX。形態學上，單純水孵胚和DMSO孵育斑馬魚幼蟲之間無顯著性差異。在8 dpf時，與未治療或DMSO治療的對照組相比，用5μM DEX治療的斑馬魚在大腦和軀干的連接區域顯示出輕微的曲線。DEX濃度從10μm增加到20μm，加重了這種表現。通過形態計量學比較頭側骨圖像時，所有處理過的胚胎在茜素紅染色組和TG（ola.sp7:nlsGFP）組中呈現出相似的結構。然而，DEX處理的幼蟲的信號強度在茜素紅染色和綠色熒光上均呈現下降趨勢。在這兩組中，暴露于5μM DEX的幼蟲的礦化面積明顯低于DMSO處理的幼蟲。將濃度增加到10或20μm進一步增強了這一差異。以上結果表明，以EGFP面積和IOD為參數的評價方法可以反映骨質量損失水平。結果與傳統的茜素紅染色結果一致，提示用TG（ola.sp7:nlsGFP）線成功地建立了斑馬魚GIOP模型。

類黃酮治療能挽救GIOP：在成功建立GIOP模型的基礎上，用從中藥淫羊藿（FE）中提取的黃酮類化合物治療該模型，其在大鼠研究中起到抗op作用，從而檢驗該模型的臨床相關性。對1μg/ml FE對斑馬魚骨生長影響的初步分析表明，FE刺激可以增加骨質量，這在熒光區和IOD中都有反映。為了研究FE對GIOP模型的修復作用，將不同濃度的FE與10μM的DEX混合，對4～8dpf的斑馬魚幼蟲進行了試驗。結果，添加1μg/ml FE的混合物將斑馬魚幼蟲從大腦和軀干連接區域的彎曲身體被挽救。TG（ola.sp7:nlsGFP）圖像的形態學分析表明，與GIOP組相比，1μg/ml FE處理幼蟲的熒光面積和IOD再次升高。這表明，1μg/mlFE處理能顯著抑制骨丟失。這些結果與傳統茜素紅染色組的圖像分析一致。上述結果表明，FE能預防骨缺損，提示FE對OP有潛在的治療作用。

成骨細胞轉錄因子Osterix、骨鈣素、骨橋蛋白以及調節骨和基質形成的破骨細胞因子Tracp被報道參與了OP。因此，qrt-PCR用于分析GIOP斑馬魚中同源成骨細胞和破骨細胞相關基因的表達水平。與DMSO治療的對照組相比，DEX治療下調了骨橋蛋白、骨鈣素和骨橋蛋白的表達水平，而TRACP表達顯著上調。與GIOP組相比，FE治療上調了Osterix、骨鈣素和骨橋蛋白的表達,但對TRACP的表達沒有影響。此外，與成骨細胞中的eGFP蛋白表達變化一致，在GIOP模型中，eGFP mRNA的表達水平也下調。

討論：我們的GIOP模型的一個局限性是，由于eGFP只標記成骨細胞，所以它不能在形成OP樣癥狀時標記破骨細胞。因此，該模型只能用于篩選對成骨細胞有直接作用的抗OP藥物。它不適合研究破骨細胞參與的組織病理學。然而，與傳統的茜素紅染色方法相比，使用TG（ola.sp7:nlsGFP）斑馬魚可以很容易地通過eGFP信號來評估骨質量和密度。它不僅消除了染色和漂白的繁瑣過程，而且避免了化學染色引起的不穩定信號。因此，該模型及相關評價方法可用于抗OP藥物的篩選。