小鼠屬脊椎動(dòng)物門，哺乳綱，嚙齒目，鼠科，小鼠屬動(dòng)物。小鼠的世代短，成熟早，繁殖很強(qiáng)，屬全年、多發(fā)情動(dòng)物，一年可產(chǎn)仔胎數(shù)6－10胎，每胎產(chǎn)仔數(shù)8－15只，且具有體型小、易于管理等特點(diǎn)。在進(jìn)化上，小鼠與人類的距離較近，約有1億年。其解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、發(fā)育過(guò)程、生化代謝途徑都與人接近，為人類疾病的克隆提供了的實(shí)驗(yàn)材料。作為經(jīng)典的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，小鼠已經(jīng)對(duì)醫(yī)學(xué)諸多領(lǐng)域的研究作出了卓越貢獻(xiàn)。

大約6000萬(wàn)年前，鼠屬出現(xiàn)在地球上，經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的繁殖和進(jìn)化，出現(xiàn)諸多分支，比如褐家鼠、倉(cāng)鼠、田鼠等。直至19世紀(jì)，寵物愛好者開始選擇性的飼養(yǎng)和馴化家鼠，從而逐漸出現(xiàn)了一些具有各種可愛顏色皮毛的寵物鼠。1897年，生物學(xué)家William Haacke 發(fā)現(xiàn)白鼠和雜色鼠雜交會(huì)產(chǎn)生重組表型。他觀察到代寵物鼠全部是雜色，但是到了第二代就出現(xiàn)了重組表型：既有白色鼠又有雜色鼠。William Haacke觀察到的現(xiàn)象實(shí)際上已經(jīng)觸及了孟德爾遺傳定律，但由于沒有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使得他的報(bào)告受到了一些爭(zhēng)議，這項(xiàng)重要的工作最終也被忽視了。20世紀(jì)初，科學(xué)家們開始用這些不同顏色的寵物鼠進(jìn)行一些遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，因此這些寵物鼠成了實(shí)驗(yàn)鼠的“先驅(qū)”。

比如1902年，哈佛大學(xué)的William Ernest Castle通過(guò)觀察的寵物鼠毛色，以驗(yàn)證孟德爾遺傳定律的正確性。1905年，法國(guó)遺傳學(xué)家Lucien Claude Cuéno對(duì)黃白相間的雜色鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)攜帶黃色皮毛基因的寵物鼠之間交配，其子代寵物鼠中黃色寵物鼠和白色寵物鼠的數(shù)量比總是2:1。Cuénot據(jù)此認(rèn)為，黃色基因?qū)Π咨騺?lái)說(shuō)是顯性的。但是這個(gè)數(shù)據(jù)似乎孟德爾遺傳定律有所出入，因?yàn)榘凑彰系聽栠z傳定律，黃鼠與白鼠數(shù)量之比應(yīng)當(dāng)是3:1，另外那部分黃色寵物鼠究竟哪去了呢？后來(lái)，Castle 和 Little經(jīng)過(guò)研究才終于發(fā)現(xiàn)，原來(lái)那些“失蹤”了的寵物鼠在還未出生就死掉了，這意味著，攜帶兩個(gè)黃色基因?qū)櫸锸髞?lái)說(shuō)是致死性的！同時(shí)，這也是所報(bào)道的個(gè)等位純合致死基因。1909年，哈佛大學(xué)生物學(xué)家Clarence Cook Little，培育出了個(gè)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)鼠株系――DBA直到今天它仍然是遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的重要實(shí)驗(yàn)材料。

1921年，Clarence Cook Little又將從Abbie Lathrop的農(nóng)場(chǎng)里買回來(lái)的一只編號(hào)為57的雌性小鼠的后代培育成了的C57BL的小鼠株系，成為使用最廣泛，最重要的小鼠株系之一。1929年， Hudson在汽車公司的巨頭Edsel Ford和Roscoe Jackson兩位大財(cái)閥的資助下，Charence Cook Little 在美國(guó)的緬因州Bar Harbor 建立了Jackson 實(shí)驗(yàn)室。該實(shí)驗(yàn)室隨后成了世界上最重要的寵物鼠遺傳學(xué)研究中心之一。

近交系小鼠的建立極大推動(dòng)了以小鼠為模型的科學(xué)研究，目前已建立的品系有近千種之多，常用的近交系小鼠也有50個(gè)品系之多。隨著克隆技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、測(cè)序技術(shù)等生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，小鼠的基因背景越來(lái)越清晰，加之在進(jìn)化地位上與人類的距離非常近，解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、發(fā)育過(guò)程、生化代謝途徑都與人接近，又由于人類對(duì)自身理解的限制、實(shí)驗(yàn)的限制和倫理學(xué)的制約，因此小鼠就成為在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等諸多領(lǐng)域的研究中重要的模式生物。

那么小鼠為什么能成為更好的模式動(dòng)物呢？這主要取決于以下四方面；
1、小鼠的基因組計(jì)劃已基本完成。基因組序列的大量信息為研究基因功能及其表達(dá)調(diào)控、胚胎發(fā)育和人類疾病的分子機(jī)制提供了條件基礎(chǔ)和技術(shù)手段；
2、小鼠生理生化和發(fā)育過(guò)程和人類相似，基因組和人類98%同源，所以很多小鼠疾病模型可以基本上真實(shí)的模擬人類疾病的發(fā)病過(guò)程及對(duì)藥物的反應(yīng)；
3、小鼠的基因改造技術(shù)成熟；從上世紀(jì)七八十年代基因改造技術(shù)誕生以來(lái)到最新的技術(shù)突破，基因改造技術(shù)在小鼠模型構(gòu)建方面日趨完善。美國(guó)科學(xué)家MarioR.Capecchi、OliverSmithies和英國(guó)科學(xué)家MartinJ.Evans因“涉及使用胚胎干細(xì)胞進(jìn)行小鼠特定基因修飾方面的一系列突破性發(fā) 現(xiàn)” 而獲得2007年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
4、小鼠繁殖能力強(qiáng)，性成熟早，體型小巧且易于管理，用于實(shí)驗(yàn)更加方便快捷。

目前，制備基因敲除的模式動(dòng)物多采用基于胚胎干細(xì)胞的同源重組技術(shù)、CRISPR/Cas9技術(shù)及TALEN技術(shù)，百奧賽圖在ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)的基礎(chǔ)上，開發(fā)并優(yōu)化出一套的基因敲除/敲入系統(tǒng)（Biocytogen Extreme Genome Editing System）簡(jiǎn)稱EGE系統(tǒng)。EGE系統(tǒng)比普通CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的同源重組效率提高了10-20倍，使得基因改造更加快速和方便。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)制備基因敲除模式動(dòng)物小鼠最快需4個(gè)月，既傳統(tǒng)又穩(wěn)定的基于胚胎干細(xì)胞的同源重組技術(shù)現(xiàn)在最快也需7個(gè)月，而利用百奧賽圖EGE系統(tǒng)最快2個(gè)月即可得到基因敲除的模式動(dòng)物小鼠。這一速度的突破有力的鞏固了小鼠在模式動(dòng)物界的地位，為我國(guó)的科研事業(yè)奠定了穩(wěn)固的基礎(chǔ)，讓生命科學(xué)研究又向前邁進(jìn)了一大步。

在生物醫(yī)藥行業(yè)，鼠是最常用的模式動(dòng)物。特別是，近年來(lái)，隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，利用基因修飾的大小鼠進(jìn)行人類疾病的前沿研究也取得了重大的成果。利用基因修飾小鼠作為人類疾病模型，一方面推動(dòng)了對(duì)人類疾病分子機(jī)制和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的了解；此外，基因編輯技術(shù)的小鼠模型也為繪制個(gè)體病理基因表達(dá)譜提供了重要科研數(shù)據(jù)，這為今后的個(gè)體精準(zhǔn)醫(yī)療奠定了重要基礎(chǔ)。

首期介紹過(guò)的ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)是獲取基因編輯小鼠的傳統(tǒng)方法，這一技術(shù)起源于上世紀(jì)80年代，1984年Bradly等實(shí)現(xiàn)了ES細(xì)胞以當(dāng)時(shí)相對(duì)較高的概率發(fā)育為嵌合體小鼠的生殖細(xì)胞系。 1987年，Thompsson等利用ES細(xì)胞技術(shù)建立了次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hprt)基因敲除的小鼠模型，此后這項(xiàng)技術(shù)獲得了長(zhǎng)足發(fā)展。然而，利用ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)建立小鼠模型因操作繁瑣復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、人力物力成本高，限制了這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用。但是，ZFN、TALEN以及CRISPR/Cas9等新興基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展顛覆了遺傳工程動(dòng)物模型的構(gòu)建方式，甚至有可能重新定義哪些物種可作為模式生物。尤其是利用最新的CRISPR技術(shù)科學(xué)家現(xiàn)在可以在短短3-4周的時(shí)間內(nèi)構(gòu)建出攜帶單個(gè)甚至多個(gè)基因突變的小鼠，而采用傳統(tǒng)的方法這需要數(shù)年的時(shí)間。并且CRISPR/Cas9具有操作簡(jiǎn)便，靶點(diǎn)選擇范圍廣，作用活性高等優(yōu)勢(shì)。

CRISPR/Cas9做為目前效率更好的基因編輯工具之一，我們這次就先來(lái)說(shuō)說(shuō)以利用CRISPR-Cas9是如何建立基因編輯小鼠模型的

實(shí)驗(yàn)步驟
1.針對(duì)特定基因序列，利用軟件（sgRNA Designer）預(yù)測(cè)潛在sgRNA序列，并依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求挑選合適的靶點(diǎn)；
2.sgRNA活性篩選，選出有活性且特異性高的sgRNA；
3.構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體，并利用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行sgRNA體外轉(zhuǎn)錄；
4.利用SP6轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行Cas9  mRNA體外轉(zhuǎn)錄；
5.將Cas9 mRNA和sgRNA按合適濃度混勻，并進(jìn)行受精卵顯微注射；
6.注射后的受精卵移植到假孕母鼠體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育；
7.待子代小鼠出生后對(duì)其進(jìn)行基因型分析。

sgRNA設(shè)計(jì)與篩選
1.選擇sgRNA靶點(diǎn)時(shí)應(yīng)挑選特異性高的序列，以避免off-target效應(yīng)；
2.將sgRNA oligo構(gòu)建至px330載體上，同時(shí)構(gòu)建含有目的基因靶序列的luciferase 表達(dá)載體上，二者共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；
3.轉(zhuǎn)染6小時(shí)后補(bǔ)液，48小時(shí)后收集細(xì)胞，并加入裂解液裂解細(xì)胞；
4.12,,000rpm離心5min，將上清液收集至潔凈EP管中；
5.按熒光素酶試劑盒進(jìn)行操作并檢測(cè)。

F0代小鼠基因型鑒定
1.取出生后5—7天小鼠組織，消化并提取基因組后進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目的條帶；
2.將PCR產(chǎn)物進(jìn)行梯度降溫退火處理，加T7E1酶并在37℃水浴酶切30min；
3.瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否能被切割為多條片段；
4.送測(cè)序分析，并保留符合要求的突變小鼠；
5.待小鼠具有生殖能力后進(jìn)行交配，以獲得足夠數(shù)量的雜合及純合小鼠。

注意事項(xiàng)：
1.體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA和sgRNA要求純度高，且在操作過(guò)程中防止RNA降解；
2.顯微注射胚胎要保證狀態(tài)良好，且數(shù)量充足；
作為協(xié)助及提供科研解決方案的生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，邦耀實(shí)驗(yàn)室基于基因編輯技術(shù)平臺(tái)，已經(jīng)成熟掌握利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因敲除、基因敲入及條件性敲除的大小鼠，可以靶向的構(gòu)建模式動(dòng)物。