實驗原理：
在變性條件下將待檢RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，使其按照分子量大小分離。按照同Southern Blot相同的原理進行轉膜，并使用探針進行雜交檢測。相比RT-PCR等技術，Northern blot具有穩定、可靠、假陽性少等優點。

實驗目的：
檢測樣品中某一特定基因mRNA的轉錄與否，以及轉錄的水平。比較兩個或兩個以上的不同樣品中某一基因的轉錄差異

材料與試劑

進口RNAase free 1.5 ml和0.5 ml管子*
進口RNAase free 20 μl、200 μl槍頭*
轉膜盤子
玻璃棒
玻璃板
膠片
濾紙
洗膜盒
DEPC水*
*注：需經高溫高壓滅菌處理。

Random Primer DNA Labeling Kit Ver 2.0 (TAKARA, catalog number: D6045)
瓊脂糖
NaAc
NaOH (國藥試劑)
EDTA (國藥試劑)
MOPS (上海生工)
NaH2PO4 (國藥試劑)
H3PO4 (85%，國藥試劑)
NaCl (國藥試劑)
Na3Citrate (檸檬酸三鈉，國藥試劑)
SDS (國藥試劑)
Deionized formamide (上海生工)
37% formaldehyde (甲醛，國產)
Glycerol (國產)
Bromphenol Blue (溴酚藍，Sigma)
Xylene Cyanol (二甲苯氰，Sigma)
1 M NaAc (pH 7.0) (見溶液配方)
4 N NaOH (見溶液配方)
0.5 M EDTA (pH 8.0) (見溶液配方)
10x MOPS buffer (見溶液配方)
1 M NaH2PO4 buffer (pH 7.2) (見溶液配方)
20x SSC (見溶液配方)
10% SDS (見溶液配方)
Sample buffer (見溶液配方)
轉膜緩沖液 (見溶液配方)
Blue juice (loading buffer) (見溶液配方)
Hibridization buffer (見溶液配方)
洗膜液 (見溶液配方)
4x SSC (見溶液配方)

儀器設備

燒杯
量筒
梳子
燒瓶
滅菌鍋
電泳槽
電泳儀
離心機

水浴鍋
通風櫥
超凈工作臺
搖床
-20 °C冰箱
紫外交聯儀
FLA-5100型熒光/化學發光及同位素影像掃描分析儀

實驗步驟

一、轉膜前預處理

先用稀釋好的0.4 N NaOH將轉膜需要用到的器皿浸泡過夜 (盤子、玻璃棒、玻璃板、燒杯、量筒、膠片、跑膠用的梳子、擋板、膠槽和制膠用的燒瓶)，然后用DEPC水清洗2~3遍，晾干待用。

二、跑膠及轉膜

先將100 ml 10x MOPS用滅菌的DEPC水稀釋至1x MOPS (1 L)，取75 ml 1x MOPS (中號電泳槽半板) 制備1%~1.2%濃度瓊脂糖膠。瓊脂糖加熱融化后，冷卻至70 °C加37%甲醛，使終濃度為2% (75 ml中加4.3 ml甲醛)，通風櫥中放1 h。剩余的1x MOPS buffer 倒入中號槽，用作電泳緩沖液。
抽提質量完好的樣品RNA測好濃度后按以下體系加樣：
15 μg RNA+滅菌的DEPC水 10 μl
Sample buffer 8 μl
loading buffer 2 μl
EB (10 mg/ml) 0.03 μl
加樣時候，先加好RNA和DEPC水，離心機短暫離心。將Sample buffer、loading buffer和EB 按照比例配成mixture，然后向每個樣品中各加10 μl。加好后，離心，65 °C水浴變性10 min，立即放冰上，點樣前再用離心機甩一下。

將膠放入加好電泳緩沖液的中號槽中，預電泳5 min。按順序點樣，不要漏出，記好樣品順序。
在中號槽中，用100 V電壓電泳1 h，直至最前方的藍色染料距離點樣孔約3.5~4 cm。將電泳好的凝膠在凝膠成像系統中照相，觀察RNA質量及凝膠電泳情況，此時應該在成像中看到RNA無降解，并且28S和18S剛好分開。這一步拍攝的圖像用于結果分析中對于樣品RNA上樣量和完整性進行描述。
在500 ml 4x SSC中加27 ml 37%甲醛(終濃度為2%)溶液，混勻用作轉膜緩沖液(轉膜緩沖液見溶液配方)。轉膜具體步驟同Southern (參見“Southern Blot”吳昊等，2018)，不同的是所用的轉膜盤子，玻璃板，玻璃棒等都是要用預先DEPC水處理好的。一切操作要在通風櫥內進行，以避免甲醛對人體的傷害。

三、雜交 

將凝膠及膜取下，分別在凝膠成像系統中觀察凝膠上是否有RNA殘留，膜上RNA效果是否完好。(可選內容：用紫外凝膠成像系統將膜中RNA拍攝下來，用作內參對照。也可以在雜交后，將探針洗去，用18S RNA探針再雜交一次，結果作為內參對照)。
將膜放在稀釋好的2x SSC中稍漂洗，然后放在干凈的濾紙上，在超凈工作臺上將水分吹干。于紫外交聯儀內以1200 ENERGY照一次30 sec，重復一次。在超凈工作臺上吹5-10分鐘。
在雜交管內加入約20~50 ml雜交液(依膜的數量及膜大小而定)，將膜卷起放入，注意有RNA的一面朝內，于64 C雜交爐中預雜交1~4 h，注意雜交管要平衡好。(也可以用雜交袋，加入雜交液后，注意不能有氣泡。后面步驟中加完探針后也要消除氣泡)。
使用“Random Primer DNA Labeling Kit”進行同位素標記探針。將探針模版(PCR擴增的基因特異片段或基因的酶切片段，經回收)測好濃度后，按以下體系加入：
DNA 3 μl (10 ng~1 μg)
Random primer 2 μl
ddH2O up to 14 μl
dNTP Mixture (不含dCTP ) 2.5 μl
10x Buffer 2.5 μl
Klenow Fragment 1 μl
α-dCTP*(同位素室中加) 5 μl
先加入DNA、random primer和ddH2O，95 °C變性3~5 min，冰上放5 min。短暫離心后，繼續加入dNTP和10x Buffer，離心后再加Klenow Fragment酶，加酶時注意低溫操作，先加在管壁上。立即到同位素室加入同位素，混勻離心，于37 °C反應30 min。
向探針標記的離心管中加入500 μl雜交液，不蓋蓋子，放于干浴上，95 °C加熱10 min。迅速放于冰中，冷卻5 min。取出雜交管，將標記產物加入雜交管，蓋緊管蓋，于64 °C雜交過夜。
注：所有廢物等需按照同位素室的相關規定放入指定容器！

四、洗膜，壓片
將雜交管中雜交液倒出，放入指定回收器皿中。取出雜交膜，放入洗膜盒，先用少量洗膜液，冷洗10 min。將膜取出測信號，根據信號大小決定是否熱洗。若信號高，換新的洗膜液，放至64 °C搖床上搖(注意轉速要調低，盒子要加蓋)。中間取出膜檢測信號，直到信號值達到適宜為止。當膜上某一區域信號強，而其他區域信號弱代表雜交上了。然后包膜壓片，壓磷屏，依信號強弱決定時間。也可以壓X光片，放于-20 °C 3天左右即可沖洗。

五、結果掃描
在FLA-5100掃描儀中，掃描磷屏。結果掃描完后，將磷屏消磁，雜交膜保存于暗夾中。如果是壓X光片，在暗室進行顯影和定影。X光片晾干后，用掃描儀將結果保存下來。

六、結果整理
將FLA-5100掃描的結果或X光片掃描結果整理，作成圖片，和電泳后的RNA檢測結果整合在一起，分析各樣品中基因的表達情況。

溶液配方

1 M NaAc (pH 7.0)
82 g NaAc先加一定量滅菌的ddH2O
NaOH調pH值至7.0
滅菌的ddH2O定容至1 L

4 N NaOH
160 g NaOH (國藥試劑)
加水至1 L溶解

0.5 M EDTA (pH 8.0)
186.1 g EDTA (國藥試劑) 先加一定量滅菌的ddH2O
NaOH調pH值至8.0
滅菌的ddH2O定容至1 L

10x MOPS buffer
MOPS (上海生工) 41.85 g
1 M NaAc (pH 7.0) 50 ml
0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ml
加一定量未滅菌的DEPC水
4 N NaOH調pH至7.0 (約加7 ml)
未滅菌的DEPC水定容至1 L，滅菌

1 M NaH2PO4 buffer (pH 7.2)
NaH2PO4 (國藥試劑) 71 g
H3PO4 (85%) (國藥試劑) 4 ml
用滅菌的DEPC水定容至1 L

20x SSC
NaCl (國藥試劑) 175.3 g
Na3Citrate (檸檬酸三鈉 國藥試劑) 88.2 g
用滅菌的ddH2O定容至1 L

10% SDS
SDS (國藥試劑) 100.0 g
滅菌的ddH2O定容至1 L (將水加熱到68 °C有助于溶解)

Sample buffer
Deionized formamide (上海生工) 1,000 μl
10x MOPS buffer 200 μl
37% formaldehyde(甲醛) (國產) 320 μl

轉膜緩沖液
500 ml 4x SSC和27 ml 37%甲醛(終濃度為2%)溶液，混勻

Blue juice (loading buffer)
Glycerol (國產) 70 ml
5x TBE 10 ml
10% SDS 2 ml
0.5 M EDTA (pH 8.0) 4 ml
Bromphenol Blue (溴酚藍，Sigma) 0.5 g
Xylene Cyanol (二甲苯氰，Sigma) 0.5 g
加滅菌的ddH2O定容至100 ml
37 °C搖動混勻過夜

Hibridization buffer
1 M NaH2PO4 buffer 500 ml
0.5 M EDTA (pH 8.0) 2 ml
10% SDS 700 ml
BSA 10 g
用滅菌的DEPC水定容至1 L

洗膜液
20x SSC 100 ml
10% SDS 10 ml
用滅菌的DEPC水定容至1 L

4x SSC
20x SSC 200 ml
滅菌的DEPC水定容至1 L

注意事項

Northern blot一個主要的問題是存在RNA酶的污染，所以Northern blot中所有的實驗用品都需要經過除去RNA酶的過程，如NaOH浸泡處理、DEPC處理等。
抽提的RNA質量一定要好，這是實驗結果好壞的關鍵，更好濃度比較一致，雜質較少。有條件的話可以先電泳檢測。
Norther blot中很多實驗用品如甲醛、EB、DEPC、紫外燈等對人體都有一定的傷害，要注意保護。
實驗所用的標記試劑盒為TAKARA公司的Random Primer Labeling Kit，模板DNA的長度一般不要低于300 bp。