外源蛋白在煙草葉片瞬時表達   
簡要原理：利用農桿菌將外源基因導入到煙草葉片中進行表達，可以借此進行蛋白的亞細胞定位、蛋白互作(BiFC)和蛋白的純化等實驗操作。

關鍵詞: 煙草, 外源蛋白, 瞬時表達
 

材料與試劑
1.一次性注射器
2.培養皿
3.本氏煙草 (Nicotiana benthamiana)
4. 農桿菌菌株：EHA105
5.MES
6.MgCl2
7. 乙酰丁香酮 (acetosyringone, AS) (上海生工，catalog number: A601111)
8. 抗生素 (根據實驗需求)
9. LB
10.0.5 M MES (pH 5.6) (見溶液配方)
11. MgCl2溶液 (見溶液配方)
12. 100 mM乙酰丁香酮 (見溶液配方)

儀器設備
1.恒溫搖床
2.分光光度計
3.移液槍
4.離心機

實驗步驟
1.挑取轉化有表達質粒的農桿菌克隆(菌株：EHA105)于1 ml含有相應抗生素的LB中，28度搖床250 rpm培養24小時。
2.于5 ml含有相應抗生素的LB中，加入100 μl 0.5 M MES，2 μl 100 mM AS，再接種50 μl農桿菌菌液，28度搖床250 rpm培養至OD600=1.0 (大約12-18小時)。
3. 4,000 rpm常溫離心10分鐘收集菌體，用10 mM MgCl2重懸至OD600=1.0，以每毫升菌液加入2 μl的比例加入100 mM AS，靜置3小時以上。
4.取正處于生長旺盛時期(一個月左右，未開花)的本生煙草(Nicotiana benthamiana)，用注射器吸入菌液，去掉針頭，以手指抵住葉片正面，將菌液從葉片的反面滲透進去(見圖1)，若注射不順暢，可用針頭在葉片上制造一個微小的傷口，再將菌液從傷口注入。
5.正常條件下放置，24-48小時即可取樣。

注意事項
1.有的文獻報道煙草注射前需黑暗處理，有的文獻則報道需要持續光照處理，個人經驗至少對于蛋白表達這一操作來說不需要任何處理，正常條件生長即可，但是用于蛋白互作(BiFC)可能需要特定的條件，可參見BiFC部分 (參見“煙草體系BiFC”，袁猛等，2018)。
2.表達載體的啟動子一般是35秒，若需要特異基因自身的啟動子驅動，需考慮水稻與煙草的單/雙子葉植物的區別造成的差異。
3.一般情況下，轉化后24小時即有蛋白表達，而48小時后會漸漸消失。
4.若需要提高外源蛋白的表達，可用同樣的方法制備含有番茄叢矮病毒基因p19超表達載體的農桿菌，與目的基因的農桿菌等量混合后再注射煙草，此方法的蛋白表達時間為注射后3-7天，且可以大幅提高表達量，但是只適用于本生煙草 (Nicotiana benthamiana) (Voinnet等, 2003)。
5.如果要抽提并純化蛋白在未用p19的情況下需5-10 g煙草葉片，加p19的情況下可以減半。

溶液配方
1. 0.5 M MES (pH 5.6)
 MES粉末溶于雙蒸水中，利用1 M KOH溶液調pH值至5.6
2.MgCl2溶液
MgCl2粉末溶于雙蒸水中
3. 100 mM乙酰丁香酮
 乙酰丁香酮粉末溶于雙蒸水中