水稻轉(zhuǎn)基因實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)

愈傷組織誘導(dǎo)
(1) 選取飽滿、無(wú)霉斑的成熟水稻種子去殼，先用無(wú)菌水沖洗3遍，然后用70%的乙醇處理1 min，不時(shí)搖動(dòng)；
(2) 用無(wú)菌水沖洗3遍，每次30 s，不時(shí)搖動(dòng)；
(3) 用0.1%升汞溶液消毒12 min，不時(shí)搖動(dòng)；
上述步驟可以在超凈工作臺(tái)外面操作，在第（3）步快結(jié)束時(shí)，用酒精棉球?qū)⒀b有消毒種子的小三角瓶擦拭干凈后拿到超凈工作臺(tái)上。
(4) 用無(wú)菌水沖洗5遍以上，每次30 s，不時(shí)搖動(dòng)；
(5) 將種子放在滅菌濾紙上吸干水分，然后用無(wú)菌鑷子夾到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；
(6) 28℃，暗培養(yǎng)4周以上。

準(zhǔn)備工作：
① 超凈工作臺(tái)的消毒：
清除臺(tái)面 → 75%乙醇噴霧超凈工作臺(tái)→ 75%的酒精棉球擦拭超凈工作臺(tái)面→ 將接種所用物品用酒精棉球擦拭干凈后放在臺(tái)面上（酒精燈，打火機(jī)，已滅菌鑷子，無(wú)菌水1瓶，已滅菌的大玻璃杯1個(gè)（盛廢液），已滅菌的小玻璃杯1個(gè)（盛95%酒精，用于消毒鑷子），盛誘導(dǎo)培養(yǎng)基的平皿若干，鋪有滅菌濾紙的平皿一個(gè)））→ 打開短波紫外線燈殺菌20-30 min，然后打開鼓風(fēng)機(jī)和工作電源，關(guān)閉紫外燈，5 min后接種；
② 接種人員首先用洗潔精洗凈雙手后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。如有可能，將胳膊做同樣消毒處理。
注意事項(xiàng)：
① 在接種過(guò)程中要經(jīng)常灼燒鑷子，防止交叉污染；
② 盡量在酒精燈下風(fēng)向的一小塊無(wú)菌空間操作，盡量避免在接種材料的上層空間活動(dòng)；
③ 接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說(shuō)話、走動(dòng)和咳嗽等；
④ 培養(yǎng)瓶上貼上標(biāo)簽，標(biāo)明接種材料和日期；
⑤ 無(wú)菌水需準(zhǔn)備2瓶，一瓶在超凈工作臺(tái)外面使用，另一瓶在超凈工作臺(tái)里面使用；
⑥ 若接種材料出現(xiàn)污染，及時(shí)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基。
附注：2 d后水稻種子開始萌發(fā)，7-10 d即從盾片處產(chǎn)生小塊愈傷組織，2 周左右愈傷進(jìn)一步膨大，此時(shí)愈傷組織質(zhì)地較硬，成塊狀，淡黃色。

愈傷組織繼代培養(yǎng)
挑選顏色鮮亮、緊實(shí)且干燥的胚性愈傷（即散落到培養(yǎng)基上的愈傷，不要選從種子上發(fā)出來(lái)的愈傷），放于繼代培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2周，溫度28℃。

預(yù)培養(yǎng)
挑選緊實(shí)且干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)4-14 d（不超過(guò)2周），溫度28℃。

農(nóng)桿菌侵染
(1) 在低溫（4℃或-80℃）保存的農(nóng)桿菌，劃線培養(yǎng)活化一次，再預(yù)培養(yǎng)2天。然后轉(zhuǎn)移至裝有懸浮培養(yǎng)基的離心管里，渦旋振蕩重懸農(nóng)桿菌，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD600大約為0.8-1.0；
(2) 挑選顏色鮮亮、緊實(shí)且干燥的胚性愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的三角瓶?jī)?nèi)；
(3) 加入農(nóng)桿菌懸浮液，浸泡愈傷30 min；
(4) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上，超凈工作臺(tái)上吹干（1 h以上）；
(5) 然后將愈傷放置在已鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)基上20℃培養(yǎng)3 d。
準(zhǔn)備工作：酒精燈，打火機(jī)，滅菌鑷子，共培養(yǎng)基，懸浮培養(yǎng)基，滅菌三角瓶一個(gè)，鋪有滅菌濾紙的平皿一個(gè)，已滅菌的小玻璃杯1個(gè)（盛95%酒精，用于消毒鑷子）

選擇培養(yǎng)

使用LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發(fā)光源將陽(yáng)性的愈傷篩選出來(lái)；
如果沒(méi)有LUYOR-3415RG,按照以下步驟篩選：

(1) 將共培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的三角瓶?jī)?nèi)；
(2) 用滅菌的蒸餾水充分洗滌愈傷；
(3) 將愈傷浸泡在含400 mg/L羧芐青霉素的滅菌水中30 min，不時(shí)搖動(dòng)；
(4) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干水分，并在超凈工作臺(tái)中晾干（約3h）；
(5) 轉(zhuǎn)移愈傷至含有50 mg/L選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2次，每次2周（次羧芐青霉素篩選濃度為400 mg/L，第二次為250 mg/L）。
準(zhǔn)備工作：酒精燈，打火機(jī)，滅菌鑷子，滅菌水1瓶，選擇培養(yǎng)基，滅菌三角瓶2個(gè)（一個(gè)用來(lái)裝愈傷，另一個(gè)用來(lái)配含400 ppm羧芐青霉素的滅菌水），鋪有滅菌濾紙的平皿一個(gè)，已滅菌的小玻璃杯1個(gè)（盛95%酒精，用于消毒鑷子），已滅菌的大玻璃杯1個(gè)（盛廢液）

分化培養(yǎng)
將陽(yáng)性或抗性的愈傷轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度28 ℃。

生根培養(yǎng)
剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根，然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，光培養(yǎng)2周以上，溫度26 ℃（轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，1-2 d就能長(zhǎng)出新根）。
準(zhǔn)備工作：酒精燈，打火機(jī)，滅菌鑷子，滅菌剪刀，生根培養(yǎng)基，已滅菌的小玻璃杯1個(gè)（盛95%酒精，用于消毒鑷子）

移栽
待苗高10 cm左右，根系發(fā)生較好，打開瓶蓋，向瓶?jī)?nèi)注入無(wú)菌水，煉苗2 d后，洗掉根上的殘留培養(yǎng)基（注意不要傷根），移栽。在最初的幾天，蒙上保鮮膜，避免強(qiáng)光照射，保持水分濕潤(rùn)。