免疫熒光方法
是最早建立的免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射后即會發出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應用較廣。

免疫熒光方法中主要步驟
1）冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片。
2）組織切片固定：切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定 5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。
3）血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般 10-30min。
4）一抗孵育條件：在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4 度、室溫、37度，其中 4 度效果更佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般 37 度 1-2h，4 度過夜（從冰箱拿出后 37 度復溫 45min）。具體條件還要摸索。
5）二抗孵育條件：一般室溫或 37 度 30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，一定要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然后去摸索一抗濃度和孵育時間。最后，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能會有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當的離心。
6）復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用 DAPI 復染。
7）封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。
8）切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，一般在一抗孵育前的清洗是 3min*3 次，而一抗孵育后的清洗均為 5 次*5min。
注意：
（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。
（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；
（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。
（4）PBS 的 PH 和離子強度的使用和要求（建議 PH 在 7.4-7.6，濃度是 0.01M；中性及弱堿性條件有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）
9）拍照：有條件的話更好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以 1~2h 為宜，超過 90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射 3~5min 后，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象；所以最多不得超過 2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟 15-30 分鐘后；標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中 4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源更好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。

背景染色較深的原因有哪些？
1、抗體濃度過高：一抗濃度過高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡單的按說明書進行染色。
2、抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程，更好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的 1 小時，而是 30 分鐘，因此，要根據染色結果進行調整。
3、DAB 變質和顯色時間太長：DAB 更好現用現配，如有沉渣應進行過濾后再用。配制好的 DAB 不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與 DAB 產生反應而降低 DAB 的效力，未用完的 DAB 存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB 的顯色更好在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監控，避免顯色時間過長。
4、組織變干：修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用 DAKO 筆或 PAP Pen 在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
5、切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長（大于 24 小時）：原因上不清楚，但現象存在。有的實驗室喜歡前將切片脫蠟至修復，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復液的容器放在 4oC 冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色，因此，不可存放時間太長。
6、一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要么不顯色要么背景著色。用新買抗體時更好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。