近期，中國熱帶科學研究院南亞熱帶作物研究所在《熱帶作物學報》發表文獻《pBBR1MCS2-Tac-EGFP廣宿主載體適宜標記Ralstonia solanacearum》。利用標記基因追蹤病原菌在植物體內的入侵和定殖，是研究病原菌-寄主互作的重要手段。本研究利用電轉化法將廣宿主載體 pBBR1MCS2-Tac-EGFP 導入青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）GMI1000 菌株中，獲得了青枯雷爾氏菌帶綠色熒光標記的轉化子。轉接試驗結果表明，轉化子的抗生素抗性和綠色熒光強度有良好的遺傳穩定性。pBBR1MCS2-Tac-EGFP 不影響 GMI1000 菌株的致病力，且 EGFP 蛋白能夠在植物中穩定表達。灌根法接種試驗結果表明，病原菌在第 1 天即完成對根系的侵染，并在第 6 天擴散至其他組織，隨后造成植株萎蔫。研究結果表明所獲轉化子可用于后續的病原菌侵染機理等方面的研究。

1.2 pBBR1MCS2-Tac-EGFP 電擊轉化及檢測

利用電轉化方法將pBBR1MCS2-Tac-EGFP轉化R. solanacearum GMI1000 菌株。GMI1000感受態的制備和電轉化方法參考張治飛[13]的方法。電擊轉化后取100 μL 的菌液涂布于含有50 mg/L 卡拉霉素的NA 固體培養基上（葡萄糖5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸膏3 g/L，瓊脂粉7 g/L），30 ℃培養48 h。利用LUYOR-3415RG 雙波長熒光蛋白激發光源在440 nm 激發光下檢測轉化子EGFP 的表達。根據EGFP 更大開放閱讀框抗性基因設計引物（EGFPF：ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC，EGFPR：TTATTTGTAGAGCTCA TCCATGCC）并且委托廣州天一輝遠基因科技有限公司進行合成。PCR 體系為：2×PCR Mix（康為世紀）12.5 μL ， EGFPF （ 10 μmol/L ） 1 μL ， EGFPR（10 μmol/L）1 μL，無菌水9.5 μL，菌液1 μL。PCR 反應程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環；72 ℃ 5 min，PCR 產物電泳檢測。將陽性克隆命名為GMI1000-Tac-EGFP。

1.6 利用GMI1000-Tac-EGFP 分析R. solanacearum動態侵染過程

馬鈴薯‘隴薯7 號’組培苗培養20 d 后進行接種。接種后置于培養箱，28~30 ℃光照培養。在接種后每24 h 利用LUYOR-3415RG 雙波長熒光蛋白激發光源在440 nm 激發下檢測EGFP 表達，并且拍照記錄。

結果與分析

2.1 pBBR1MCS2-Tac-EGFP成功轉入GMI1000

本研究通過電轉化法成功地將 pBBR1MCS2-Tac-EGFP 轉入到 GMI1000 中。通過 PCR 在GMI1000-Tac-EGFP中擴增出 750 bp左右的片段，與預期大小一致，而 GMI1000 中未擴增出相應片段（圖 2）。同時在 LUYOR-3415RG 雙波長熒光蛋白激發光源的藍光下，GMI1000-Tac-EGFP 能夠發出綠色熒光，而野生型 GMI1000 未發出熒光。研究結果證明 pBBR1MCS2-Tac-EGFP成功轉入到 GMI1000 中，并且能夠在 GMI1000中表達 EGFP 蛋白。

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