在GFP的中心是由三個氨基酸經(jīng)自催化形成的一個共軛體系。事實上很多分子都具有熒光性質(zhì)，但是大共軛體系的能級更細(xì)，而且吸收和發(fā)光譜段都在可見光區(qū)，再加上GFP優(yōu)良的生物合成性質(zhì)，所以被廣泛用于活體生物檢測。不過在活體生物檢測中使用化學(xué)合成的熒光分子作標(biāo)記也是很常見的，其不依賴于生物合成，有更高的可控性，當(dāng)然成本也更高。

在蛋白質(zhì)分子中, 能發(fā)射熒光的氨基酸有色氨酸(Trp )、酪氨酸(T yr) 以及苯丙氨酸(Phe)三種。個別蛋白質(zhì)分子含有的黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD ) 也能發(fā)射熒光。Trp、Tyr 以及 Phe 由于其側(cè)鏈生色基團(tuán)的不同而有不同的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。其中 Trp 的熒光強(qiáng)度更大, Tyr 次之, Phe 最小。

三種氨基酸都都屬于芳香類氨基酸。發(fā)出熒光通常在 280 nm 或更長的波長被激發(fā)，如果想選擇性的激發(fā)色氨酸，要選擇295 nm的波長。 Phe 在 絕大多數(shù)實驗條件下不被激發(fā), 所以很少能觀察到 Phe 的發(fā)射。因此，蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來自 Trp 和 Tyr 殘基。Trp 殘基對微環(huán)境的變化很敏感, 并且大多數(shù)蛋白質(zhì)都含有幾個不同的 Trp 殘基, 因而常作為內(nèi)源熒光探針來研究溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

色氨酸發(fā)出的熒光是如何根據(jù)微環(huán)境變化而變化的呢？ 這個問題很有趣。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于折疊狀態(tài)時，如果在蛋白質(zhì)內(nèi)部含有色氨酸，色氨酸周圍的環(huán)境主要是疏水的，此時色氨酸發(fā)出的熒光的強(qiáng)度會很高，同時發(fā)出熒光的更大光強(qiáng)度在波長330 nm處。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處在解折疊狀態(tài)時，色氨酸完全暴露在溶液中，周圍環(huán)境是親水的，此時色氨酸發(fā)出熒光的強(qiáng)度會變低，同時發(fā)出熒光的更大光強(qiáng)度的波長會增大，移動到350 nm處

熒光蛋白發(fā)光特性

GFP吸收的光譜更大峰值為395nm（紫外），并有一個峰值為470nm的副吸收峰（藍(lán)光）；發(fā)射光譜更大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder）。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發(fā)光對細(xì)胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。

上圖為煙草在LUYOR-3410紫外線燈照射下觀察到的效果

GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強(qiáng)，特別是在450～490nm藍(lán)光波長下更穩(wěn)定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強(qiáng)，因此更適用于定量測定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。但因為GFP不是酶，熒光信號沒有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白，比如熒光蛋白的應(yīng)用非常的廣泛（如上圖）， 已經(jīng)應(yīng)用于分子標(biāo)記，體內(nèi)示蹤，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，藥物篩選等生物科研的各個方面熒光讓我們能夠檢測分子的構(gòu)象變化，也能讓我們追蹤化學(xué)反應(yīng).... 是科學(xué)研究的重要手段之一。與熒光相似，生物發(fā)光也常用在實驗室中。與熒光不同，生物發(fā)光不需要激發(fā)光照射。

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