過表達(dá)載體主要是將目的基因的編碼區(qū)（CDS）構(gòu)建到相應(yīng)的質(zhì)?；蛘卟《据d體中，達(dá)到在目的基因過量表達(dá)的作用。常規(guī)過表達(dá)載體</B>主要元件：Promoter—gene—linker—Fluorescent gene—抗藥篩選gene?；蜻^表達(dá)載體又可以分為廣泛?jiǎn)?dòng)子基因表達(dá)載體，組織特異性啟動(dòng)子基因表達(dá)載體和誘導(dǎo)啟動(dòng)子基因表達(dá)載體等，以達(dá)到不同研究所需要的目的。

載體構(gòu)建(vectorconstruction)：為把DNA分子運(yùn)送到受體細(xì)胞中去，必須尋找一種能進(jìn)入細(xì)胞、在裝載了外來的DNA片段后仍能照樣復(fù)制的運(yùn)載體。理想的運(yùn)載體是質(zhì)粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。

過表達(dá)載體的構(gòu)建方法及步驟

一、載體的選擇及如何閱讀質(zhì)粒圖譜
目前，載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質(zhì)粒 DNA 是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。
一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素：
（1）復(fù)制起始位點(diǎn) Ori 即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物 DNA 分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而真核生物 DNA 分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。
（2）抗生素抗性基因 可以便于加以檢測(cè)，如 Amp+ ,Kan+
（3）多克隆位點(diǎn) MCS 克隆攜帶外源基因片段
（4） P/E 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子
（5）Terms 終止信號(hào)
（6）加 poly（A）信號(hào) 可以起到穩(wěn)定 mRNA 作用
選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。

過表達(dá)實(shí)例--pCAGGS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠原代神經(jīng)元

載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：
【1】構(gòu)建 DNA 重組體的目的，克隆擴(kuò)增/基因表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。
【2】.載體的類型：
（1）克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大?。ù筮x大，小選小 ） 。如<10kb 選質(zhì)粒。
（2）表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。
（3） 對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意： 選擇合適的啟動(dòng)子及相應(yīng)的受體菌， 用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服4個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位；表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。
【3】載體 MCS 中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接 ， 不能產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。
綜上所述，選用質(zhì)粒（最常用）做載體的5點(diǎn)要求：
（1）選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體） ；
（2）一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般 10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè)。
（3）必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地；
（5）滿足自己的實(shí)驗(yàn)需求，是否需要包裝病毒，是否需要加入熒光標(biāo)記，是否需要加入標(biāo)簽蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
 無論選用哪種載體， 首先都要獲得載體分子， 然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體 DNA 進(jìn)行切割， 獲得線性載體分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。
 
如何閱讀質(zhì)粒圖譜
步：首先看 Ori 的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）
第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。
（1）Ampr 水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。
（2）tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。
（3）camr 生成氯霉素羥乙?；苌铮怪ザ拘浴?br/>（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使 G418（長(zhǎng)那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活。
 第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS） 。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些酶切位點(diǎn)以外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb 的外源 DNA 片段。一般來說，外源 DNA 片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。
第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體。克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。

第六步：?jiǎn)?dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)
（1）啟動(dòng)子－促進(jìn) DNA 轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列，這個(gè) DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼序列的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。
（2） 增強(qiáng)子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。
（3）核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs） ：mRNA 有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。
（4） 轉(zhuǎn)錄終止序列（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA的保守序列，此位點(diǎn) down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號(hào)。結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA 的保守序列，此位點(diǎn) down－stream 有一段GT 或 T 富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號(hào)。
質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針， 那其實(shí)是代表兩條 DNA 鏈， 即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA，它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上 .根據(jù)表達(dá)宿主不同，構(gòu)建時(shí)所選擇的載體也會(huì)不同。
 
二、目的基因的獲得
 一般來說，目的基因的獲得有三種途徑：
調(diào)取基因：根據(jù)目的基因的序列，設(shè)計(jì)引物從含有目的基因的cDNA中通過PCR的方法調(diào)取目的基因，鏈接到克隆載體挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序，以獲得想要的基因片段，這種方法相對(duì)成本較低，但是調(diào)取到的基因往往含有突變，還有不同基因的表達(dá)豐度不同，轉(zhuǎn)錄本比較復(fù)雜，或是基因片段很長(zhǎng)，這些情況都很難調(diào)取到目的基因。
全基因合成：根據(jù)目的基因的DNA序列，直接設(shè)計(jì)合成目的基因。此方法準(zhǔn)確性高，相對(duì)成本會(huì)高一些，個(gè)人操作比較困難，需要專業(yè)的合成公司完成。優(yōu)點(diǎn)是可以合成難調(diào)取及人工改造的任何基因序列，同時(shí)可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化，提高目的基因在宿主內(nèi)的表達(dá)量。

三、克隆構(gòu)建
目前，克隆構(gòu)建的方法多種多樣，除了應(yīng)用廣泛的酶切鏈接以外，現(xiàn)在還有很多不依賴酶切位點(diǎn)的克隆構(gòu)建方式。下面具體說一下雙酶切方法構(gòu)建載體的步驟。

（2）X基因慢病毒載體的構(gòu)建
X基因 基因由Transheep全基因合成，構(gòu)建于載體PUC57中。PUC57-X基因 EcoRI/BamHI酶切結(jié)果：
Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder (從上至下依次為：3000bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp,  500bp, 250bp,100bp)
Lane2：PUC57-Neurod1 EcoRI/BamHI酶切產(chǎn)物
酶切完成后進(jìn)行膠回收
2. 載體用pCDNA3.1雙酶切，酶切體系如下。
20ul酶切體系    37度3小時(shí)

酶切完成后膠回收（見附錄）
Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder (從上至下依次為：12000bp, 8000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2500bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp)
Lane2： pcDNA3.1載體酶切回收產(chǎn)物
轉(zhuǎn)化 (感受態(tài)細(xì)胞: DH5a),具體步驟見附錄轉(zhuǎn)化部分。
抗性: Amp; 37℃，培養(yǎng)過夜
轉(zhuǎn)化后X基因分別平板挑菌, 37℃ 250轉(zhuǎn)/分鐘搖菌14小時(shí)，PCR鑒定后，將陽性菌液送上海權(quán)陽生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
X基因 慢病毒載體單克隆菌落PCR鑒定（使用載體通用引物,PCR條帶大小應(yīng)比實(shí)際大200bp左右）：
Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder  (從上至下依次為：2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp,100bp)
Lane2-4： X基因 菌落鑒定PCR產(chǎn)物

載體構(gòu)建中需要注意些什么？
一、PCR 過程中的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)
做分子克隆，構(gòu)建表達(dá)載體的過程中，目的片段必須跟genebank 中的序列完全一致才行，所以在 PCR 過程中酶的選擇首先應(yīng)選擇高保真酶，尤其是當(dāng)目的片段較長(zhǎng)的時(shí)候更是如此。這樣才能在 PCR 過程中減少錯(cuò)配情況。高保真酶常常對(duì)退火溫度有要求，對(duì)一般的酶來說，退火溫度是 Tm-5 度，但如 NEB 的高保真酶的退火溫度是 Tm 值+3 度。PCR 循環(huán)數(shù)不宜太大，20-30 即可。我就曾經(jīng)用普通的酶進(jìn)行過 PCR，擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)非特異條帶，T-A 克隆后送去測(cè)序，發(fā)現(xiàn)堿基有錯(cuò)配，而且每次都不一樣。

二、PCR 產(chǎn)物直接酶切后連接不成功
當(dāng)你獲得 PCR 產(chǎn)物后，首先是進(jìn)行純化、酶切、純化，然后與酶切后膠回收的載體連接，如果連接成功，當(dāng)然是恭喜了。但往往會(huì)出現(xiàn)連接不成功的，原因以 PCR 產(chǎn)物沒有酶切成功可能性大，這可能與引物設(shè)計(jì)的好壞有關(guān)。因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候 PCR 產(chǎn)物是否酶切成功是無法鑒定的，所以你反復(fù)嘗試幾次還不成功的話，就趕緊做個(gè) T-A 克隆吧

三、T-A 克隆應(yīng)注意的問題
T-A 克隆應(yīng)該時(shí)間很簡(jiǎn)單的事，但知者不難，難者不知啊，還是有很多問題要注意的。T-A 陽性率高，簡(jiǎn)單易操作，所以在質(zhì)粒構(gòu)建過程常常用來選擇做為一個(gè)亞克隆，既可以用來測(cè)序，又有利于進(jìn)一步酶切，確實(shí)很方便。但要注意，首先是 T 載體的選擇，盡量避免選擇含有目的片段酶切位點(diǎn)的 T 載體，這樣會(huì)切成多個(gè)片段，有時(shí)候可能對(duì)后面的膠回收會(huì)有影響。其次，因?yàn)樵?PCR 產(chǎn)物是用高保真酶擴(kuò)增的，所以首先要進(jìn)行加 A 反應(yīng)。這時(shí)候應(yīng)購(gòu)買 T-A 快速克隆平末端加A 試劑盒。進(jìn)行加 A 時(shí)反應(yīng)體系不要太小，因?yàn)樘∈敲噶考拥目赡懿粶?zhǔn)確。我開始就是這樣，想著節(jié)約，說明書寫的是 PCR 產(chǎn)物加 15ul,我沒舍得，加了 3ul,加A 反應(yīng)液、酶都相應(yīng)減量，后面就是轉(zhuǎn)化不成功。后來我 PCR 產(chǎn)物加為 6ul,就成功了，屢試不爽。最后，在連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞后，輕彈混勻，稍微離心一下，不要?jiǎng)×业恼鹗?，反正我失敗的時(shí)候都是力度較大，也不知道有沒有關(guān)系。

四、菌液 PCR
T-A 克隆成功后，你可以看到很多藍(lán)白斑，一般來說藍(lán)斑要比白斑稍多。不是每個(gè)白斑都是你要的東西，下面就是陽性克隆的篩選了。挑白斑到搖菌管過夜搖菌，然后進(jìn)行菌液 PCR。關(guān)于菌液 PCR 引物的問題，有的人用克隆引物，有的人用專門設(shè)計(jì)的檢測(cè)引物，兩者我都用過，只要檢測(cè)引物能 P 出來，克隆引物也能 P出來，完全符合，所以一般的時(shí)候用克隆引物就可以了，除非運(yùn)氣不好，真好在起始點(diǎn)就出現(xiàn)錯(cuò)配的情況。

五、堿法小提質(zhì)粒
挑取陽性克隆的菌液，抽提質(zhì)粒吧。既然是小提，就不要很多菌液，一管就夠了，3-5 毫升，開始以為菌液越多越好，其實(shí)是錯(cuò)的，首先這點(diǎn)菌液提的質(zhì)粒夠你測(cè)序及酶切用了，其次加多了反而不好，因?yàn)榧拥牧呀庖菏窍鄬?duì)固定的，多了可能裂解不完全啊。提取質(zhì)粒有傳統(tǒng)的自己配制的酚氯仿抽提，也可以購(gòu)買試劑盒。我還是傾向于用試劑盒，尤其是像我們這些并不打算在實(shí)驗(yàn)方面有所專長(zhǎng)的初學(xué)者。國(guó)產(chǎn)的試劑盒很便宜，如天根的質(zhì)粒小提試劑盒，一次大約也就 4 塊錢，足夠用的了。而用酚氯仿抽提吧，很容易出現(xiàn)質(zhì)粒不純的情況，在測(cè)序時(shí)無法測(cè)出信號(hào)。當(dāng)然，這也可能跟個(gè)人有關(guān)，師姐們都建議后者，在他們看來，簡(jiǎn)單實(shí)用，價(jià)格更便宜。如何選擇，就看自己的了。

六、酶切膠回收
測(cè)序結(jié)果正確的話那就恭喜你了，至少你已經(jīng)拿到了目的片段，下面就酶切膠回收吧。將目的片段及載體進(jìn)行酶切，并行酶失活，然后電泳膠回收。我回收過幾次，但回收效率不高，也不知是什么原因。跑膠時(shí)條帶很亮，酶切也很充分，但一回收就沒了，尤其是目的片段常常都看不到。很郁悶，這時(shí)候我多做了兩個(gè)酶切回收體系，同時(shí)進(jìn)行膠回收，加大量回收后跑電泳總算能看到目的片段了，雖說不亮，但總算有。個(gè)人認(rèn)為，將 50ul 的酶切體系不要放在一個(gè)孔里面跑膠而是分成兩到三個(gè)孔跑膠然后回收可能會(huì)增加回收的效率。

七、酶切產(chǎn)物連接
載體與目的片段的摩爾比常常為  1：3-10，但酶切回收后的產(chǎn)物測(cè)濃度常常測(cè)不出來。怎么去按這個(gè)比例進(jìn)行連接反應(yīng)呢。回收后將目的片段和載體同時(shí)跑膠比較亮度，根據(jù)亮度的比較再結(jié)合分子量來確定兩者的體積比。如亮度比為 5：1，兩者的分子量比 10：1，體積比大約為 1：3.  不要擔(dān)心產(chǎn)物的濃度低會(huì)影響連接，其實(shí)連接只要那么一點(diǎn)點(diǎn)就夠了。我的陽性對(duì)照加的質(zhì)粒只有 0.1ng，結(jié)果菌落長(zhǎng)得滿滿的。

八、挑取陽性克隆送測(cè)序
轉(zhuǎn)化成功后挑取陽性克隆的菌液進(jìn)行質(zhì)粒小提，同時(shí)保存菌種，送測(cè)序。