綠色熒光蛋白之光--生物技術綜合大實驗課程教學的改革與探索
生物技術(biotechnology)是以現代生命科學為基礎，結合其他基礎學科的科學原理，以基因工程為核心，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的。同時，生物技術也是一門綜合性和實踐性很強的學科。綜合大實驗是培養學生在掌握一定的基礎知識和基本技能的基礎上，綜合運用各學科的理論知識和實驗技能解決實際問題能力的實踐過程。西北農林科技大學生命學院生化與分子生物學教研室為本院三年級本科生，在先修生物化學、分子生物學、基因工程等專業課程的基礎上，開設了以水母綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的原核表達、分離、純化和鑒定為主要內容的生物技術綜合大實驗。經過不斷的實踐和探索，我校生命科學學院在綜合性設計性實踐教學上取得了良好的教學效果。現將我們在教學過程中的體會與同行加以交流，以期拋磚引玉。

1 實驗設計
綜合性實驗指的是實驗內容涉及綜合知識及方法、手段對學生理論知識、實踐能力及思維方式所進行的聯合培養。眾多的教學研究實踐證明，綜合性實驗是培養學生良好專業技能的有效手段[2]。但如何在有限的教學學時完成基本技能的訓練和培養學生的綜合科研能力，是教學設計的難點之一。在蛋白質純化中，多個步驟存在大量的重復性檢測工作，使學時的有效性大大降低。為此，把科研中成熟的先進方法和技術充實到實驗教學中很有必要。GFP被稱為21世紀的顯微鏡，當它受到藍光照射時，會吸收藍光的部分能量發射出明亮綠色的熒光。GFP熒光是生物細胞的自主功能，不需要任何外源反應底物即可產生，作為標記物在細胞內可穩定表達并易于觀察和檢測(LUYOR-3410高強度紫外燈下就可以觀察)。其直觀的特點可有效克服重復純化檢測步驟與學時的矛盾。生物技術綜合大實驗以GFP為純化目標，在傳統純化手段訓練的同時，結合標簽融合技術的設計，有效對比實驗結果讓學生體會技術進展對蛋白質純化的推進作用。

2 實驗目的
生物技術綜合大實驗的目的對本科生來說主要體現在四個方面：
(1)鞏固前期所學理論知識。生物技術綜合大實驗教學內容要緊密結合本科生前期學習的生物化學、分子生物學、基因工程、酶工程等專業科目，培養理論基礎扎實，動手能力較強的創新型人才，加深學生對生物技術知識體系的認識；
(2)綜合掌握各項生物技術實驗的基本技能。綜合大實驗內容設計上拋棄了以前分散的、孤立的單純學習某一實驗技術的缺陷，將單個實驗綜合為系統的、連貫的系列型基本生物技術大實驗，涉及質粒提取、感受態細胞制備、質粒轉化、陽性克隆鑒定、擴大培養及誘導表達、表達蛋白的提取、鹽析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析、透析及聚丙烯酰胺凝膠電泳等多種技術，使學生接受多種生物技術實驗基本技能的訓練；
(3)提高發現問題和解決問題的能力。系統性和連貫性是綜合大實驗的基本特征，前一部分的實驗結果即為后一部分的實驗基礎。前面實驗的結果對后面實驗的開展及實驗的最終結果都具有很大的影響。因此，學生必須積極主動地關注實驗的整個過程，對實驗中出現的問題要認真分析，找出原因，從而提高分析問題和解決問題的能力；
(4)在學習基本知識和基本實驗技能的同時，關注學科前沿技術，體會新技術發展對科學發展的推動作用。

3 實驗具體內容及技術路線
為了實現實驗設計的目標，我們安排了以下九個分實驗：
實驗一 細菌培養；
實驗二 質粒提取及感受態細胞制備；
實驗三 質粒轉化及誘導表達；
實驗四 硫酸銨沉淀純化GFP；
實驗五 疏水層析純化GFP；
實驗六 離子交換層析純化GFP；
實驗七 凝膠過濾層析純化GFP；
實驗八 親和層析純化GFP；
實驗九 純化GFP的SDS-PAGE分析。

4 實驗前期準備
4.1 使學生熟悉實驗內容和實驗相關技術的基本知識
生物技術綜合大實驗課程內容涉及面廣，需要實驗室老師和實驗課程指導教師以及學生之間的密切配合，才能達到預期目的。對于實驗室老師來說，需要準備好綜合大實驗所必需的各種儀器設備、試劑和耗材，并使各種儀器設備達到良好的使用狀態；實驗課程指導教師不僅要與實驗室老師配合做好各項準備工作，而且要熟悉各種儀器的操作規程，更重要的是指導學生做好實驗前期的準備工作；實驗實施前一月指導教師要與自己所代班級學習委員提前聯系，讓學生認真自學本校郭藹光老師主編的“生物化學實驗技術”部分(理論部分)中生物大分子的分離制備、離心技術、層析技術和電泳技術的基本知識，使學生熟悉生物大分子制備前的處理、生物大分子的提取和生物大分子分離純化的常用方法和技術[5]。同時，使學生熟悉綜合大實驗的目的和具體內容，并結合學過的相關知識，查閱文獻，根據實驗要求和提供的條件提出實驗方案，對實驗方案進行討論和優化，提交指導教師審閱。

4.2 加強學生科學精神和科學思維的培養
GFP是1962年下村修在美國西北海岸所盛產的水母中所發現的一種蛋白質。GFP分子由238個氨基酸殘基構成，11個β-折疊，形狀呈圓柱形，第65-67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發光團，是一種全新的非酶性報告基因，已廣泛應用于蛋白質表達純化、蛋白質相互作用、蛋白質細胞內定位示蹤和模式生物轉基因等生物學研究中[6-8]。日本科學家下村修(Osamu Shimomura)、美國科學家馬丁·沙爾菲(Martin Chalfie)和美籍華裔科學家錢永健(RogerY. Tsien)，以其在GFP的發現及發展中所做出的杰出貢獻，而共同獲得了2008年的諾貝爾化學獎[9]。因此，在實驗過程中把學生對GFP發現發展的歷史，及其在生物研究中的相關應用的學習和理解作為一項重要內容很有必要。不但能使學生了解GFP的前世與今生，更為重要的是使學生從中學習和領悟科學家的科學精神和科學的思維方式，并融入到自己的學習實踐中，提高其創新能力。為此，我們實驗實施前兩周向學生推薦周程“諾貝爾獎級的科學成就究竟是怎樣取得的?——綠色熒光蛋白的發現、表達與開發”和“杰出人才是怎樣煉成的？——下村修榮獲諾貝爾化學獎案例研究”、張國增等“下村修科研歷程的啟示”和馬三梅等“從綠色熒光蛋白的發現談如何提出新穎的科研問題”等文章[10-13]，要求學生認真學習寫閱讀筆記和讀后感想。實驗前教師進行檢查和提問，使學生詳細地了解GFP分子的發現、GFP基因的分離與復制、GFP基因的表達、GFP突變體的開發、GFP類似物的篩選與改進的歷史進程，了解三位科學家的學術貢獻以及加深對GFP的理解，學習GFP發現過程中是如何提出問題以及提出問題所用的思維方式。啟發學生運用求異和置換的思維方式來提出新穎的科研問題，并設計實驗來回答提出的問題，從而為學生完成綜合大實驗奠定良好的基礎。例如，一位同學在讀后感中這樣說：“在閱讀完文獻之后，給我印象深刻的是科學家們在科研道路上所展現的專業精神、奉獻精神，這一切的背后都是源于他們對生命的熱愛和激情，以及他們探索真理所帶有的強烈使命感。GFP的發現、表達與開發的過程說明，你得有一顆耐得住寂寞，一絲不茍，善于觀察，細心發現，敢于追根究底的心。在不斷失敗中依然不氣餒，不認輸，鍥而不舍的精神。當然，縝密的邏輯思維，過硬的專業基礎，從不停止的創新意識也是必不可少的。在以后的學習和科研道路上，我會時刻提醒自己做到以上幾點，同時，保持一顆年輕跳動永不麻木的心。”另一位同學在讀后感中這樣說：“科學研究中重要的是提出問題，在實驗中出現一個現象時，要想為什么會出現這種現象，通過這種現象又能提出什么新的問題。GFP發現過程中，提出問題所運用求異和置換的思維方式，對于即將步入實驗室工作的我們，有著很好的啟發作用。”

5 實驗實施過程
5.1 實驗時間安排
生物技術綜合大實驗，通常安排在每年春季學期的后半學期，實驗周期2周。

5.2 充分發揮學生的積極性和主動性
綜合大實驗與常規本科實驗不同，具有系統性、連續性和協作性，在實驗過程中，把班級分若干個實驗小組(4人一組)，并選出1名小組組長，負責召集本組同學對實驗方案進行討論，明確組員的分工。鼓勵學生根據提供的實驗材料和設備，依據所學的基本知識和理論，提出合理可行的實驗方案。例如在質粒轉化中，既可采用化學轉化法，也可采用電擊轉化法。在化學轉化法中，可選擇傳統的轉化方法或快速的轉化方法。在GFP分離純化時，有些組選擇陽離子交換，而有些組選擇陰離子交換。有些組選擇線性梯度洗脫，而有些組選擇階段式洗脫[14]。在實驗中GFP需要經過疏水、離子交換、親和層析和凝膠過濾四次層析純化，學生針對自己的樣品進行自主操作[15]。對實驗中出現的問題，要求學生積極思考，查閱相關資料，進行組內討論，分析原因，提出解決方法。金屬螯合親和層析是近年來出現的一種新型親和層析技術。相對于傳統的分離蛋白質技術，如凝膠過濾層析、吸附層析、離子交換層析等，親和層析的更大特點是和簡便，其通常只需經過一次處理即可快速、簡便地使目標蛋白質從復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。通過親和層析和傳統分離蛋白質技術的比較，學生可親身體驗到新技術對分離蛋白質的巨大優勢。例如一位同學在實驗報告的總結中這樣說：“本次實驗以GFP為材料，使我們在實驗過程中直觀地觀察到實驗的進程，通過對GFP的提取、分離、純化和鑒定等一系列過程，深入了解了如何對蛋白質進行分離和純化，鞏固了相關理論知識，提高了實驗技能，同時也感受到了團隊合作的和共享。”
5.3 規范實驗操作，認真做好實驗總結
先前的單項實驗大多是教師首先給學生講授實驗原理、實驗步驟和注意事項，然后學生“照方抓藥”進行實驗操作，學生往往只知其然，不知其所以然。雖然之前學生也做過不少化學和生物化學等實驗，但是還有許多學生實驗操作不規范，普遍和典型的一個現象就是用完移液管后隨意放在實驗臺面上，而不是放在移液管架上。在實驗過程中，對學生不規范的實驗操作，教師要及時指出并予以糾正。例如，整個實驗過程中，都要用LUYOR-3410高強度紫外線燈監測GFP，了解其在整個實驗過程中的變化；在細菌培養、感受態細胞制備、擴大培養過程中要嚴格無菌操作，防止污染；層析柱的填充要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡，否則要重新裝住。平衡和洗脫時，必須保持柱材濕潤，不能干柱或裂縫，否則分離純化將前功盡棄；四次柱層析實驗中柱材料一定要嚴格區分不能相互混用，否則柱子將失效。許多同學在實驗報告的總結中都談到，綜合大實驗使自己體會到，做任何實驗都必須清楚每一步在做什么，為什么這么做。
實驗報告是綜合大實驗課程的重要環節，重點考查學生應用已學習的基本理論和知識，對實驗思路、實驗結果、實驗條件、實驗方法和實驗技術等做出綜合性的系統的總結和分析，提高學生分析問題和解決問題的能力[16]。要求學生按照論文格式完成實驗報告，包括以下幾部分：封面、正文(文獻綜述、實驗部分)、參考文獻、附錄(實驗的原始數據)。對實驗中的異常現象，要依據所學的基本知識和理論進行細致分析，找出原因，并提出改進意見。

6 考核方式
建立以提高學生素質為目標的考核體系，對于調動學生參加生物技術綜合大實驗的積極性和主動性具有重要的導向作用。為此，我們建立了以平時成績(實驗預習記錄、閱讀筆記和實驗課前提問) 、實驗成績(實驗中操作規范、參與程度和實驗報告)作為學生綜合大實驗課程的最終成績(平時成績30%、實驗成績70%)。這就督促學生在綜合大實驗的前期準備和實驗過程以及實驗報告的各個環節充分發揮自己的主觀能動性，積極認真地參與到綜合大實驗的全過程，通過自己的親身實踐體會科學研究的艱辛和喜悅，提升自己的科學素養和創新能力。例如，2013級生物技術專業2班33名學生考核結果中，總分85分6名(18.2%)，88分4名(12.1%)，90分12名(36.4%)，92分2名(6.1%)，95分9名(27.3%)。課程從2005年開始實施，至今已有12年之久，歷經過數輪的課程改革，學生從最初的本院生物技術專業擴展到生物科學專業，從生命學院延伸到本校創新學院。學生評價生物技術大實驗課，內容系統完整，理論知識通過實驗得到了強化，開闊了眼界，拓展了知識，培養了科學思維和科學精神，大大提高了動手能力及分析和解決問題的能力等綜合素質。總之，多年的教學實踐證明，生物技術綜合大實驗使學生的實驗操作技能、團結合作的精神、嚴謹的科學態度、分析問題和解決問題的能力，都得到了很好的訓練和提高，是提高學生綜合素質和創新能力的有效途徑。

 文章作者：李科友*，武永軍，劉林麗，劉晶瑩，陳 鵬*楊凌西北農林科技大學生命科學學院， 712100