熒光蛋白及其在微生物過程工程中的應用
 熒光蛋白是一系列在紫外光激發下產生熒光的發光蛋白，以其熒光穩定性好、靈敏度高、無毒害等優點廣泛應用于諸多領域。目前成功開發的熒光蛋白有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、藍色熒光蛋白(blue fluorescent protein,BFP)、青色熒光蛋白(cyan fluoroscent protein,CFP)、黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)。熒光蛋白在微生物工程中菌株篩選方面的應用逐漸成熟，菌株篩選是菌種工程中較為耗時、費力的步驟，熒光蛋白為菌株篩選提供了新突破口。本文從熒光蛋白的基礎研究出發，綜述了近年來熒光蛋白在微生物工程中菌株篩選方面的進展和基于熒光蛋白的新型微生物篩選技術,為熒光蛋白等其他發光蛋白在微生物菌種工程的應用提供參考。

20世紀60年代初，MORISE等[1]從多管水母(Aequorea victoria)中分離出一種發光蛋白，并命名為aequorin。由于aequorin在紫外光(UV)或藍光激發下會發出綠色熒光，所以被稱為綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)。后來，PRASHER等[2]發現GFP發出的綠色熒光是由于接受了來自熒光素酶-羥基熒光素激發態復合物或Ca2+激活發光蛋白的能量而產生。這個發光過程發生在水母傘底部的一種特殊的上皮細胞中，屬于一種生物的通訊功能或防御機制。綠色熒光蛋白的編碼基因(gfp)可以被整合到其他生物體，而使其他生物體發出熒光。因此，利用基因工程技術將gfp基因與其他蛋白質融合表達為研究細胞生物學的重要手段[3]。TSIEN基于GFP發光機理，通過基因突變得到一系列不同顏色的熒光蛋白。這些不同顏色的熒光蛋白HEIM和SAITO等[4-5]可以實現同時跟蹤多種蛋白質的狀態和多個生物事件[6-7]、過程[8]。微生物育種是食品和生物工程領域不可缺少的工作。但是微生物篩選步驟費時費力，制約了微生物的快速、高通量篩選。多種熒光蛋白的出現為微生物育種提供了有力工具[9]。本文從不同種類的熒光蛋白性質出發，介紹熒光蛋白在微生物育種方面應用的進展，為微生物育種的開展提供參考。

1 熒光蛋白
1.1 GFP
目前不同顏色的熒光蛋白主要有5種。其中GFP的研究最早，也最成熟。GFP是由238個氨基酸組成的單體蛋白，分子量為27 kD[10]。GFP分子呈β-圓筒狀，由11條β-鏈形成外壁，圓筒的直徑為3 nm，長為4 nm，兩端由α-螺旋覆蓋，將負責發光的基團緊緊地包裹在筒中央[11-12]。GFP在300～500 nm波長激發下發出綠色熒光[13]，并且能保持10 min以上。馬金石等[14]研究表明，從C-端除去多于7個氨基酸或者帶蛋氨酸的片段就會導致失去熒光。圓筒內條β-折疊片開始于N-端的第10個氨基酸，N-端前10個氨基酸形成帽子的主要成分，保護發色團在筒內中心位置，形成非常緊密牢固的結構。這種狀態下的熒光不會由于和氧的相互碰撞而被碎滅從而導致量子產率降低。GFP發色團由位于65～67處的Ser-Tyr-Gly環狀三肽組成，該氨基酸三聯體以共價形式與GFP的骨架相連[15]。INOUYE等[16]和HEIM等[17]的研究證實氧氣是GFP發出熒光的必要成分。野生型GFP的生色團在β-筒狀結構中與周圍的氨基酸殘基、少量水分子形成氫鍵網絡結構,如圖1所示[18]。

GFP的一個引人注目的特點是，其生色團的形成沒有物種的特異性，可以在生成2～4 h后自動催化得到[19]。CORMACK等[20]對野生型GFP定點突變可以增強GFP熒光強度的綠色熒光蛋白，稱為增強型GFP綠色熒光蛋白。GFP的突變體也會改變熒光蛋白的發光特征。野生型GFP的主激發峰為397 nm，副激發峰為476 nm，發射峰約509 nm。GFP突變體S6ST的激發峰紅移至484 nm，發射峰變為507 nm，且熒光強度比野生型GFP高5倍。進一步突變得到的突變體GFP F64L是一種在37℃下、成熟的增強型GFP[21]。這種突變體的缺陷是對pH值敏感且較易形成二聚體。近來，從溫水珊瑚中分離得到的GFP趨向于形成二聚體，通過突變可以得到2個單體蛋白mGFP、mGFPI和二聚體蛋白dGFP的亮度是增強型GFP的2倍以上，具有很大的潛在應用價值[22]。

1.2 其他顏色的熒光蛋白
CORMACK等[20]改變野生型GFP基因，導致其吸收光譜和發射光譜發生變化，最終改變熒光蛋白的熒光強度與熒光顏色，由此可以獲得不同顏色的熒光蛋白。藍色熒光蛋白(blue flrorescent protein,BFP)是將珊瑚野生型GFP中的66位酪氨酸突變為組氨酸(Y66H)或雙突變體Y66H/Y145F后得到能在約380 nm激發光產生448 nm藍光的蛋白。但是這些突變體的藍色熒光的熒光量子產率很低，是GFP的15%～20%。由于BFP的激發光接近于紫外光，不僅穿透力很弱，還容易在操作中傷害細胞以及導致細胞的自熒光現象，因此應用較少[23]。與得到BFP的方式類似，將GFP的66位酪氨酸突變為色氨酸得到青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)。CFP的激發波為433和445 nm，發射波長為475和503 nm。研究者們觀察GFP晶體結構，發現第203位蘇氨酸和熒光基團的空間距離非常近，所以把蘇氨酸突變為酪氨酸(T203Y)來穩定激發態下熒光生色團的偶極矩。這個突變體(T203Y)使熒光蛋白的激發波長和發射波長紅移約20 nm，呈現出黃綠色的熒光，被稱為黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)[11]。對YFP進一步突變可得到熒光更加強烈的增強型黃色熒光蛋白(enhanced yellow fluorescent protein，eYFP)。當前研究致力于降低YFP對于氯離子和pH的敏感性,以實現其在成像方面的應用[24]。后來，將GFP的第65位絲氨酸突變為蘇氨酸，得到突變體S65T。突變體S65T的激發譜中只有一個峰，且紅移至490 nm，呈現紅色熒光，稱為紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)。

2 利用熒光蛋白作為標記篩選目的細胞
隨著科技的發展，重組DNA技術(recombinant DNA technology)在微生物育種方面應用越來越普遍。甚至全基因組改組(genome shuffling)已經應用到微生物育種過程中[31]。為了篩選到性狀優良的微生物，很多科學家也都在細胞篩選重組微生物領域不斷進行深入研究。與常規的篩選方法相比，利用熒光蛋白作為探針篩選目的菌株具有快速有效、簡單易行和實用性強等特點。近年來，各種熒光蛋白在工業微生物菌種改良的多個方面取得進展。
熒光蛋白具有基因片段相對較短(700 bp)，表達載體構建相對容易，基因錯配幾率小等優點。近年來，很多學者將熒光蛋白作為篩選標記用于細胞、基因、代謝物的篩選。例如單志新等[32]以GFP作為報告蛋白篩選能夠有效抑制目的基因表達的siRNA；王弘[33]等構建了通用載體質粒融合系統(UPS)，獲得了、簡便的帶有GFP的釀酒酵母，為GFP的重組表達提供了良好的技術儲備。目前，利用熒光蛋白作為標記篩選微生物也用于解決實際問題中,例如徐明等[34]利用GFP標記棉花黃萎病菌成功獲得大麗輪枝菌轉化株。大麗輪枝菌轉化株的獲得為后續大麗輪枝菌侵染棉花過程的組織學和致病機理研究提供了良好的基礎。熒光蛋白也被用于篩選一些能夠表達特定功能的藥物細胞。泛素-蛋白酶體通路(UPP)是細胞內重要的蛋白質降解系統，影響惡性腫瘤等細胞發生與發展[35]。蛋白酶體抑制劑通過阻斷UPP，可抑制腫瘤細胞生長，成為腫瘤治療的新方法。方海同等[36]基于GFP的篩選模型，得到大量、穩定表達蛋白酶體抑制劑的細胞株，推進了治療腫瘤的研究。目前，微生物育種過程中單細胞基因分析較難。將熒光蛋白與一些可以和DNA片段結合的蛋白質融合，例如組蛋白結合蛋白和熒光蛋白融合(H-NS-mcherry and HMG-mCherry)，來篩選已經發生突變的細胞[37]。
3 基于熒光蛋白表征細胞內狀態
細胞內的狀態影響細胞內蛋白質構象，例如蛋白質錯誤折疊和聚集。所以檢測蛋白質的構象可以說明細胞內狀態。VENTURA等[38]采用GFP作為模型蛋白，篩選可以阻止蛋白質錯誤折疊的化學分子。這種思路也被拓展應用于利用化學熒光分子表征細胞內蛋白質狀態。例如KUCHERAK等[39]采用熒光分子(6FM-M和7AFM-M)標記突觸核蛋白說明突觸核蛋白的狀態。GFP的生色團和目標蛋白融合表達可以指示目標蛋白是否錯誤折疊[40]。熒光蛋白還被開發為pH值敏感的分子[41]，將pH變化轉變為光顏色的變化，表征細胞內pH值。在pH 6.8～7.8之間，隨著pH值的升高，熒光蛋白強度增強[42]。
4 基于熒光蛋白的細胞篩選策略
為了提高細胞表達外源蛋白的表達效率，借助一些物理化學因素(如UV誘變、NTG誘變等)引入隨機突變，構建細胞文庫，篩選出能夠表達目的蛋白的突變體。傳統的篩選方法(例如96孔板中的篩選)工作量很大，而且隨機性大。因此，高通量篩選技術逐漸興起，如液滴微流體技術，微流體技術最初用于電子領域中。MANZ等[43]提出了“微全分析系統”的概念，即把生物和化學領域涉及到的樣品制備、分離和分析檢測等基本操作單元集成到芯片上，以替代傳統的生物和化學實驗室的一種新型分析分離技術。液滴微流體技術篩選目的菌株需要在液滴觀察之后恢復活性。然而，為防止液滴連續相和分散相的蒸發，微流體通道或腔室通常處于密封狀態，對細胞正常生長不利[44]。因此為了改善這些不足，DAGKESAMANSKAYA等[45]提出光轉換熒光蛋白在液滴微流篩選中的應用，該技術使用光驅動標記液滴，在微流體觀察室中直接生長細胞，可以直接恢復目的細胞的活性。該方法基于綠色到紅色可切換熒光蛋白的細胞內表達，在顯微鏡下監測液滴中細胞的生長，用熒光激活細胞分選機進行分選并回收[45]。此外，通過該方法篩選的細胞基本能恢復到初始狀態，所以這種光轉換熒光蛋白在液滴微流控篩選中具有廣闊的應用前景。近幾年，關于利用液滴流體技術篩選細胞的報道也與日俱增[44,46-47]。如HUANG等[48]利用微流控篩選和全基因組測序，結合熒光鑒定與酵母蛋白分泌α-淀粉酶改善相關的突變，經突變后的酵母細胞與標有綠色熒光蛋白的α-淀粉酶混合，然后用油包封形成液滴。通過熒光底物降解的液滴的熒光強度選擇出更高產的淀粉酶突變體。
陳建武等[49]借助新潮霉素和熒光蛋白2類標記篩選建立了的基因敲除系統，稱之為“雙熒光”系統。該策略以GFP和新霉素基因為正篩選標記，以紅色熒光蛋白基因為負篩選標記，篩選出目的細胞。WANG等[50]通過兩個真正遠紅外的探針(更大發射波長為625 nm和649 nm)與青色、綠色、黃色和橙色熒光蛋白結合進行多色標記成像。
隨著對熒光蛋白研究的深入，發現熒光蛋白發射的熒光可以通過不同波長的光來控制，從而產生3種熒光蛋白:光激活熒光蛋白(photoactivated fluorescent protein,PAFPs)、光轉換熒光蛋白(photoconvertible fluorescent protein,PCFPs)、光開關熒光蛋白(reversible photoswitching fluorescent protein，PSFPs)。其中PCFPs是指光照后熒光蛋白從一種發射短波長的熒光狀態不可逆地轉變為另外一種發射長波長的熒光狀態。目前為止，報道的由綠轉紅的熒光蛋白主要有Dendra2、Eos、Kaede和KikGR[51]，這些熒光蛋白具有相同的生色團His-Tyr-Gly，光轉換前發射綠色熒光，光轉換后變成紅色熒光，在細胞篩選方面發揮著重要作用。但是目前對于光轉換蛋白的研究較少，需要繼續開發更多種類生色團的熒光蛋白。
5 展望
目前，GFP的種類較為完全，在微生物過程工程研究中應用甚廣，主要集中在細胞篩選。微流體技術能實現通過調節其“熒光強度閾值”將目的細胞分級篩選，進而，“雙熒光”篩選和光轉換篩選策略克服了單熒光篩選中篩選效率不高，復活率不高等問題。總之，熒光蛋白在細胞篩選的研究中仍然是熱門領域。但是基于熒光蛋白篩選細胞也存在著一些問題與不足，如檢測的靈敏度還有待進一步提高；熒光強度的非線性性質使其定量非常困難；紫外激發對某些熒光蛋白有光漂白和破壞作用；多數生物具有微弱的自發熒光現象，并有著類似的激發和發射波長等。所以，熒光蛋白在細胞篩選甚至其他領域的應用仍需要繼續完善。

文章作者：毛洪麗，劉雨，張建國*(上海理工大學 醫療器械與食品學院，食品科學與工程研究所，上海，20093)

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