DsRED 紅色熒光蛋白植物表達載體的構建和表達

為獲得紅色熒光蛋白(Red fluor escent pro tein, RFP)真核表達載體35S-pC1301-DsRED, 利用PCR 將瞬時表達載體PGDR 上的全長DsRED 擴增下來并用Xba Ⅰ 和Bam H Ⅰ 酶切該片段, 同時用相同的內切酶消化中間載體pBluescript SK(+), 連接兩片段并測序, 將鑒定正確的DsRED 用相同的內切酶切下并導入雙元載體35SpC1301, 利用基因槍將正確質粒轉染洋蔥內表皮細胞瞬時表達DsRED。結果表明:35S-pC1301-DsRED 真核表達載體已成功構建并在熒光共聚焦顯微鏡下呈現紅光, 即獲得了可產生紅色熒光的35S-pC1301-DsRED 載體,為今后植物目的基因定位提供了陽性對照, 同時中間載體pBluescript SK(+)-DsRED 的構建為今后植物目的基因定位提供了實驗工具。
　紅色熒光蛋白RFP(Red f luo rescent pro tein)是從印度太平洋與海葵相關的Discosomasp 中分離得到的一種生物發光蛋白, 它能在紫外線激發下發出紅色熒光。RFP 的激發波長和發射波長較長, 其更大激發波長為558 nm , 更大發射波長為583 nm ,且發射峰位于培養基、組織培養器材及細胞成分等產生的熒光背景范圍之外。
近年來, 隨著熒光蛋白多樣性在紅色光譜范圍內的發現[ 2] , 不同形式的DsRED 相繼用于細胞分子生物學的研究 。這些蛋白可與GFP 一起應用于雙重標記實驗或在轉基因植物中作為一個單獨的報告基因。報告基因(Repor ter gene)技術是將一段順時調控序列插入報告基因上游以控制報告基因的表達, 從而直觀地“報道”該順時調控序列的表達調控以及與其相關信號轉導通路的活動。到目前為止, 本實驗室獲得的紅色熒光蛋白是在PGDR 載體上的DsRED[ 7] , 因PGDR 為單元載體不能應用于轉化真核生物材料, 不利于直觀形象的研究生物體內的基因功能, 為此將DsRED 導入中間載體和雙元載體, 這對于今后研究生物體內目的蛋白的功能提供了一種新的實驗工具。

本研究旨在構建PGDR 載體上的DsRED , 用X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ 雙酶切DsRED 序列并導入雙元載體35S-pC1301 , 最終構建成35S-pC1301-DsRED雙元表達載體, 并觀察構建后的35S-pC1301-DsRED 在洋蔥內表皮細胞中的瞬時表達情況, 從而為進一步利用DsRED 作為報告基因奠定了基礎。

1 　材料與方法
1 .1 　材料
1 .1 .1 　菌株與質粒　pBluescript SK (+)質粒(Promega)35S-pC1301[ 8] ;DH5α(上海閃晶分子生物公司);含有DsRED 片段的pGDR 質粒[ 7] 。
1 .1 .2 　試劑和儀器　PCR 引物;Genclean 柱式瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質粒抽提試劑盒;Marker 、高保真Taq DNA 聚合酶、dN TP 、限制性內切酶X ba Ⅰ和BamH Ⅰ 、T4 DNA 連接酶、T4 連接buf fer 、氨芐霉素(AMP)及卡那霉素(Kan)等。PCR 儀(Eppendo rf );電泳儀(Tano nEPS100);水平電泳槽);基因槍(Bio -Rad PDS -1000);激光共聚焦熒光顯微鏡(ZEISS LSM510 ME TA)。
1 .2 　方法
1 .2 .1 　PCR 擴增及片段回收　運用DNAS TAR軟件根據DsRED 序列設計引物, 分別引入X ba Ⅰ和BamH Ⅰ 酶切位點, 所用引物:DsRED-F5′-TCTAGAGCCA TGGCCTCCTCCGAGAA-3′;DsRED-R 5′-GGA TCC T TACAGGAACA GG TGGTGGC-3′(下劃線處為引入酶切位點X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ )。以pGDR 質粒為模板進行PCR,DsRED-F 和DsRED-R 擴增DsRED 序列, 瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后, Genclean 柱式瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收目的片段, 利用X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ 酶切該片段。試驗中PCR 的反應條件為:94 ℃預變性為3 min , 94 ℃變性30 s , 58 ℃退火1min , 72 ℃廷伸45 s , 共35 個循環, 72 ℃充分延伸10 min 。PCR 產物用內切酶消化3 h , 酶切完成后用1 %的Ag arose 凝膠電泳驗證該酶切產物。
1 .2 .2 　大腸桿菌培養　感受態細胞的轉化, 質粒提取, 鑒定等按分子克隆實驗指南2000 版進行。
1 .2 .3 　中間載體pBluescript SK(+)-DsRED 的獲得　利用T4 DN A 連接酶將X ba Ⅰ 和B amH Ⅰ 消化的PCR 產物與pBluescript SK(+)連接, 4 ℃過夜后轉化DH5α, 在含AMP 抗性的LB 固體培養基平板上37 ℃培養16 h 后有白色菌落長出, 挑取菌斑在含有AMP 抗性的LB 液體培養基內培養, 其OD 值約為1.2 ～ 1.4 左右后, 試劑盒提取質粒, 用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ 進行雙酶切鑒定, 1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后, 送公司測序。
1 .2 .4 　35S-pC1301-DsRED 質粒的獲得　將鑒定正確的pBluescript SK(+)載體上的DsRED 序列與載體35S-pC1301 同時用X ba Ⅰ和Bam H Ⅰ雙酶切后利用T4 DNA 連接酶對其進行連接, 將上述連接產物轉化DH5α, 在含有Kan 抗性的LB 固體培養基平板上37 ℃培養16 h 后有白色菌落長出。挑取單菌落在含有Kan 抗性的LB 液體培養基內過夜培養, 其OD 值約為1.2 ～ 1.4 左右后, 用試劑盒提取質粒, 利用X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ 進行雙酶切, 1 %瓊脂糖凝膠電泳驗證該酶切產物。
1 .2 .5 　35S-pC1301-DsRED 瞬時表達與觀察　洋蔥內表皮細胞中35S-pC1301-DsRED 蛋白瞬時表達參照Col ling s 等 。基因槍轉化操作參照Bio-Rad 操作手冊進行(PDS-1000/He), 壓力選擇范圍在1 100 -1 300psi 之間。樣品在激光共聚焦顯微鏡(Zei ss LSM510 ME TA)上觀察和拍照。激發波長設置:RFP 543 nm 。

2 　結果與分析
2 .1 　PGDR 載體上目的片段DsRED 的獲得在PGDR 載體上DsRED 序列的兩端設計引物DsRED-F 和DsRED-R , 同時兩條引物中分別引入酶切位點X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ 。
以pGDR 質粒為模板進行PCR , 擴增出680 bp的DsRED 片段, 瓊脂糖電泳鑒定正確后(圖1),Genclean 柱式瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收目的片段, 將回收的PCR 產物用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ 進行酶切, 消化完全后, 電泳并割膠回收目的片段。

圖1 　PGDR 載體上PCR DsRED 結果

2 .2 　中間載體pBluescript SK(+)-DsRED 的導入及鑒定
用X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ 消化pBluescript SK(+)中間載體, 消化完全后, 同樣利用試劑盒將切開的載體片段進行電泳回收(圖2)。將用相同雙酶切的PCR 產物和pBlue script SK(+)中間載體利用T4DNA 連接酶進行連接, 轉化DH5α, 獲得含有目的片段的克隆, 即pBluescript SK(+)-DsRED , 利用X ba Ⅰ 和B amH Ⅰ 對其進行酶切驗證(圖2), 兩片段長度分別是pBluescript SK(+)3Kb 和DsRED680 bp 左右, 電泳驗證酶切片段后, 送公司測序, 測序結果正確。

圖2 　SK(+)空載體酶切及重組載體SK(+)-DsRED 酶切鑒定

2 .3 　雙元載體35S-pC1301-DsRED的獲得及鑒定
用X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ 消化雙元載體35SpC1301, 通過凝膠電泳回收獲得11 Kb 左右的DNA 片段(圖3), 同時, 將目的片段DsRED 用相同的酶從鑒定正確的pBluescript SK(+)-DsRED 上切下, 利用T4 DNA 連接酶進行連接, 轉化DH5α,獲得含有目的片段的克隆, 即35S-pC1301-DsRED ,用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ 酶切驗證, 兩片段長度分別是11 Kb 左右和680 bp 左右, 電泳驗證酶切片段正確(圖3), 即獲得了35S-pC1301-DsRED 雙元載體。

圖3 　雙元載體35S-pC1301 酶切及重組載體
        35S-pC1301-DsRED 酶切鑒定

2 .4 　轉染洋蔥細胞后35S-pC1301-DsRED 的瞬時表達
利用基因槍轉染法將35S-pC1301-DsRED 質粒轉染洋蔥內表皮細胞, 28 ℃ 24 h 黑暗培養后在熒光共聚焦顯微鏡下進行觀察, 在543 nm 激發光下有發明亮紅色熒光的洋蔥表皮細胞出現(圖4CD),而對照空載pC1301-35SN , 在熒光共聚焦顯微鏡下無紅色熒光細胞產生(圖4A-B)。從而獲得可產生紅色熒光的35S-pC1301-DsRED 載體, 說明可產生紅色熒光的35S-pC1301-DsRED 載體已被成功構建。

圖4 　重組載體35S-pC1301-DsRED轉染洋蔥內表皮細胞

3 　討論與結論
DsRED 是一種生物發光蛋白, 因其紅色熒光有較強的穿透力, 作為報告基因已被廣泛應用于動物、植物和酵母等真核生物 。它在激發波長為543nm 的條件下, 不需加入任何底物就可以發出紅色熒光, 所以DsRED 可以作為一種新型的報告基因來研究植物、動物細胞基因的表達與調控以及蛋白定位、轉基因植物的亞細胞定位等方面的研究。
DsRED 具有很高的消光系數和熒光量子產量,這些特性表明, DsRED 發射熒光的強度要比羅丹明B 等染料和更好的GFP 突變體的強度高得多, 其抗漂白能力強于GFP 及其黃色熒光突變株, 以及增強型綠色熒光蛋白(GFP)和增強型黃色熒光蛋白(CFP)。另外, DsRED 對pH 值不敏感, pH 值為4.5 ～ 12 時仍保持穩定, 這使其使用范圍更加廣泛。RFP 穿透性強且持續時間長, 在原核生物中成功地實現了DsReD2 的融合表達, 且不需要特殊的激發光源即可在日光下觀察到較強的紅色熒光[ , 比觀察GFP 更加方便。
本研究所應用的轉基因方法簡單、效率高、易成功。pBluescript SK(+)-DsRED 的構建是基于中間載體pBluescript SK(+)的MCS 含有較多的限制性內切酶位點, 為以后DsRED 作為報告基因和植物目的基因同時導入植物體進行直接研究提供了很好的工具, 同時為目的基因進行DsRED 和GFP共定位提供了很好的中間載體, 可使目的基因定位更加準確。本研究對PGDR 、35S-pC1301 進行構建, 獲得了35S-pC1301-DsRED 真核表達載體并成功轉染洋蔥內表皮細胞, 在熒光共聚焦顯微鏡下發現細胞可呈現明亮的紅色熒光。35S-pC1301-DsRED 克隆轉染洋蔥內表皮細胞具有穩定性好、熒光持續時間長、不破壞細胞結構及直接觀察等優點,為構建高表達載體在植物亞細胞定位方面開辟了一條新途徑。

論文作者：董偉欣，河北農業大學農學院，張迎迎 中國科學院上海植物生理生態研究所

如果要觀察Dsred紅色熒光蛋白（red Fluorescent Protein)的表達，美國路陽生產的便攜式熒光蛋白激發光源可以選擇LUYOR-3260GR和LUYOR-3415(X)G系列雙波長熒光蛋白激發光源。紅色熒光蛋白采用綠光激發，佩戴LUV-50A紅色觀察眼鏡觀察，如希望提供更多詳細信息，可直接聯系上海路陽生物技術有限公司的銷售客服。