農桿菌轉化擬南芥
1．農桿菌感受態制備
① 從 YEB 平板培養基上挑取農桿菌單克隆，接種于 5 mL YEB （含 50μg/mL 利福平）液體培養基中，28oC，200 rpm，過夜培養；
② 取2 mL過夜培養液接種于50 mL上述含有利福平的YEB液體培養基中，28oC，200 rpm，搖床培養至 OD 達到 0.5；
③ 菌液冰浴 30 min，轉至預冷的 50 mL 離心管中，4oC，5000 rpm，離心10 min，收集菌體；
④ 2 mL 預冷的 50 mM 無菌 CaCl2 溶液（含 15%甘油）懸浮菌體，即為感受態細胞；以 100 μl/管分裝，液氮速凍后，保存于-70oC 冰箱，備用。

2．質粒轉化農桿菌感受態
① 吸取構建好的表達載體質粒 5 μl，加入到 100 μl 感受態細胞中，混勻；
② 冰浴 30 min，液氮冷凍 5 min，37oC 熱擊 5 min；
③ 加入 800 μl YEB 液體培養基，28oC，200 rpm，搖床培養 5 h；
④ 離心，留 200 μl 上清重懸沉淀，將菌液涂于 YEB 固體培養基（含質粒對應的抗生素），28oC 培養 2 d，挑取單克隆，檢測篩選陽性克隆，搖菌后-70oC 保存，用于下一步植物轉化。

3．農桿菌侵染擬南芥花序
① 將篩選的陽性農桿菌在 YEB（抗生素）固體培養基劃板培養，至長出單克隆后挑 3-5 個單克隆，于 5 mL YEB（抗生素）液體培養基中，28oC，
200 rpm 培養 16 h，（以培養基變得很渾濁為準），保菌之后全部接到250-500 mL 的培養基中，培養 16 h 以上；
② 5000 rpm 離心 20 分鐘，然后用轉化液（1/2MS（只用大量和微量元素），添加 50 g/L 的蔗糖，調 pH 為 5.8 左右，然后加 200 ul/L 的 Silwet L-77混合），劇烈懸浮沉淀至完全懸起；
③ 在擬南芥盛花期，將懸浮液直接浸泡地上部分約 1 分鐘，然后用保鮮膜
完全包裹以保濕，放回培養室 12 小時以上打開保鮮膜；
④ 待種子成熟后（半個月左右），收取種子用于下一步篩選工作。

4．擬南芥轉基因苗篩選
① 種子消毒：用 75%的酒精添加 0.1%的 Triton X-100 在 1.5 mL 的離心管中搖晃 15 min，然后在超凈臺中用 95%的酒精洗兩次，最后一次直接把種子連同酒精倒在滅菌過的濾紙上，濾紙直接放在超凈臺上，吹干種子（30min 以上），然后把濾紙對折，左手捏著一角，右手拿一把鑷子輕輕敲擊濾紙把種子均勻撒到篩選培養基上；
② 抗性苗篩選：MS 培養基中加 25 mg/L 的氨芐青霉素，抑制細菌的生長；根據質粒抗性，在培養基中還得加 20 mg/L Basta 或 25 mg/L 潮霉素。篩選培養 15 d 左右，把陽性苗轉移到土中，用透明的薄膜蓋 3 d 左右以保濕；
③ PCR 鑒定：提取抗性苗 DNA，外源基因特異引物檢測基因整合情況；
④ 熒光定量 PCR 分析：提取抗性苗 RNA，外源基因特異引物檢測基因表達情況。