蛋白表達載體系統
重組蛋白表達技術和重組蛋白表達載體現已廣泛應用于生物學各個具體領域,尤其是體內功能研究和蛋白質的大規模生產。蛋白表達載體按照表達宿主的不同分為3類:B類，M類和Lv類。B類的表達宿主為大腸桿菌，M類的宿主為哺乳動物細胞，Lv類是慢病毒載體，宿主可以為哺乳動物細胞或原代細胞。

除了必要的復制和篩選的元件，協助表達和翻譯的元件外，本文將各類載體按熒光蛋白標簽、多功能標簽、促溶解度標簽和抗體免疫共沉淀標簽四種，先將幾種主流的標簽功能初步介紹如下：

eGFP/eCFP/eYFP/mCherry
分別是增強型綠色熒光蛋白/增強型黃綠色熒光蛋白/增強型黃色熒光蛋白/單體紅色熒光蛋白標簽,具有不同的激發波長和發射波長，均由野生型熒光蛋白通過氨基酸突變和密碼子優化而來。就eGFP而言，相對于GFP，其熒光強度更強、熒光性質更穩定。同時載體中構建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。mCherry是從DsRed演化來的性能更好的一個單體紅色熒光蛋白，可以和GFP系列熒光蛋白共用，實現多色標記體內、外實驗表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白時，熒光蛋白活性和被融合的目標蛋白功能相互沒有明顯影響。
這些熒光標簽蛋白，其融合表達目的蛋白后具有以下優點：
1.不用破碎組織細胞、不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達情況，而且熒光性質穩定，被譽為活細胞探針。
2.其自發熒光，不需用目的基因的抗體或原位雜交技術就可推知目的基因在細胞中的定位等情況。
3.同時細胞內的其它產物不會干擾標簽蛋白檢測，從而使其檢測效果更快速、簡便、靈敏度高而且重現性好。
4.其低消耗、高靈敏度檢測的特性，十分適用于高通量的藥物篩選。現eGFP 表達標簽被廣泛地應用于基團表達調控、轉基因功能研究、蛋白在細胞中的功能定位、遷移變化及藥物篩選等方面。
5.mCherry紅色熒光蛋白在標記病毒顆粒，研究病毒和宿主細胞之間更有得天獨厚的優勢。如用mRFP或mCherry標記HIV病毒顆粒，研究H1V和宿主細胞問的相互作用以及HIV侵染宿主細胞的過程．用mRFP標記慢病毒顆粒，研究慢病毒在小鼠體內的復制過程等。
熒光素酶
來源于生物體內的熒光素，常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶。這些熒光素酶作為“報告蛋白”被用于分子生物學研究中，這種技術被稱為報告基因檢測法或螢光素酶檢測法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白標簽不同，使用熒光素酶構建的報告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究啟動子、miRNA 3'UTR克隆的功能與調控，因為它們對目的基因的調控可以是漸變的，而不是簡單的開和關兩種狀態。
優點：靈敏度高，檢測幅度寬；不是哺乳動物細胞內源性基因；重復性好；與HTS兼容等。螢火蟲和海腎熒光素酶已經被廣泛應用于協同報告并進行均一化研究。由于它們都是快速，容易和高靈敏的監測方法。而且螢火蟲和海腎熒光素酶是理想的雙基因報告系統，因為它們來源于不同的生物進化方向，蛋白結構和底物差異都很大，在實驗中不會產生相互影響。
基于熒光素酶的特性，我司研發提供的Secrete-Pair? Dual Luminescence Assay Kit可用于分析雙報告系統中Gaussia熒光素酶（GLuc）和分泌型堿性磷酸酶
(SEAP)活性。GLuc 和SEAP均為分泌型報告蛋白，無需裂解細胞即可便捷地從細胞培養液中取得樣本，并對實驗結果進行精準的實時分析。

SNAP-Tag
SNAP-Tag是新一代的蛋白標簽技術，不僅專一性極高而且穩定，更大的優點是適用于多種環境下的蛋白質檢測與純化，如活細胞內、溶液中、或固態相(如SDS-PAGE gels)等。
SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）獲得。無論體內還是體外，SNAP-Tag都能與底物高特異性地共價結合，使蛋白標記上生物素或熒光基團（如熒光素和若丹明）。SNAP所帶的活性巰基位點接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側鏈苯甲基基團，釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價結合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團所帶的標記物。苯甲基鳥嘌呤在生化條件下穩定，并且沒有其他蛋白會和這類物質作用，所以SNAP標簽反應是高特異的。
檢測：生物素或各種顏色熒光的底物（如熒光素、若丹明）可滲透進入細胞，方便快捷地進行活細胞內SNAP-Tag融合蛋白的標記與檢測。它們也可特異性地標記大腸桿菌，酵母和哺乳動物等細胞抽提液或已經純化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。
將純化的或未純化的SNAP-Tag融合蛋白與表面固定了苯甲基鳥嘌呤的基質混合，蛋白即可特異與底物作用，形成共價鍵，融合蛋白間接被固定在了基質表面上，可以達到更方便快捷地研究蛋白功能或純化蛋白的目的。

Halo Tag ?
HaloTag?標簽蛋白是一種脫鹵素酶的遺傳修飾衍生物，可與多種合成的HaloTag?配基有效地共價結合，是多功能標簽的一種。這個分子量為33KDa的單
體蛋白能融合在重組蛋白的N端或C 端，并在原核和真核系統中表達。HaloTag?配基是小分子化學物，能夠在體外或體內與HaloTag?蛋白共價結合。這些配基由兩個關鍵組分組成：(1)一個通用的HaloTag?反應聯結子，結合HaloTag?蛋白；(2)一個功能基團,例如熒光染料或親和媒介。能夠共價和特異性結合多種合成的報告基團和親和配基的特性，使得HaloTag?蛋白能夠用于檢測和親和結合或固相化固定目的蛋白。

Avi Tag
AviTag ?標簽蛋白是一個15 個氨基酸的短肽，具有一個單生物素化賴氨酸位點，是多功能標簽的一種。與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標蛋白的N端和C端。融合表達后，可被生物素連接酶生物素化，作為純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質分離純化，還用于蛋白質相互作用研究。
Avi Tag標簽系統具有以下幾大優點:
1.無論在體外或者體內，幾乎所有的蛋白都可以在一個獨特的Avi Tag位點輕易且有效地被生物素化；
2.生物素化是通過酶和底物的反應來實現，反應條件相當溫和而且標記的專一性極高；
3.生物素AviTag只有15個氨基酸，對蛋白空間結構的影響非常小。

His6：
His6是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標簽的使用，一是能構成表位利于純化和檢測；二是構成獨特的結構特征（結合配體）利于純化。組氨酸殘基側鏈與固態的鎳有強烈的吸引力，
可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對重組蛋白進行分離純化，是促溶解度標簽的一種。
使用His-tag有下面優點：
1.標簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標蛋白的功能；
2.His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應用，后者在純化包涵體蛋白時特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復性不受其它蛋白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復性；
3.His標簽融合蛋白也被用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA相互作用研究；
4.His標簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫制備抗體；
5.可應用于多種表達系統，純化的條件溫和；
6.可以和其它的親和標簽一起構建雙親和標簽。

Flag:
Flag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），是一種促溶解度標簽，同時載體中構建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。
FLAG作為標簽蛋白，其融合表達目的蛋白后具有以下優點：
1.FLAG作為融合表達標簽，其通常不會與目的蛋白相互作用并且通常不會影響目的蛋白的功能、性質，這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究。
2.融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過FLAG進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高。
3.FLAG作為標簽蛋白，其可以被抗FLAG的抗體識別，這樣就方便通過Western Blotting、ELISA等方法對含有FLAG的融合蛋白進行檢測、鑒定。
4.融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現FLAG標簽已廣泛的應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關領域。

MBP:
MBP（麥芽糖結合蛋白）標簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。作為促溶解度標簽家族中一員，MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP標簽可通過免疫分析很方便地檢測。有必要用位點專一的蛋白酶切割標簽。如果蛋白在細菌中表達，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。
純化：融合蛋白可通過交聯淀粉親和層析一步純化。結合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進行洗脫。結合親和力在微摩爾范圍。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效結合，而其他融合蛋白則不受影響。 緩沖條件為pH7.0到8.5，鹽濃度可高達1M，但不能使用變性劑。如果要去除MBP融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。
檢測：可用MBP抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。

GST:
GST(谷胱甘肽巰基轉移酶) 標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶，它的天然大小為26KD，是一種促溶解度標簽。將它應用在原核表達的原因大致有兩個，一個是因為它是一個高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個是它可以在大腸桿菌中大量表達，起到提高表達量的作用。GST融合表達系統廣泛應用于各種融合蛋白的表達，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。結合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二體。GST標
簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩定性。在大多數情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。
純化：該表達系統表達的GST標簽蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathionesepharose)親和樹脂進行純化。GST標簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強變性劑如：鹽酸胍或尿素等。
如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。
檢測：可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。

SUMO
SUMO標簽蛋白是一種小分子泛素樣修飾蛋白（Small ubiquitin-likemodifier），作為促溶解度標簽的一種，SUMO是泛素(ubiquitin)類多肽鏈超家族的重要成員之一。在一級結構上，SUMO與泛素只有18%的同源性，然而兩者的三級結構及其生物學功能卻十分相似。研究發現SUMO可以作為重組蛋白表達的融合標簽和分子伴侶，不但可以進一步提高融合蛋白的表達量，且具有抗蛋白酶水解以及促進靶蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。
此外SUMO還有一項重要的應用，就是可用于完整地切除標簽蛋白，得到天然蛋白。因為SUMO蛋白水解酶（我公司可提供）能識別完整的SUMO標簽蛋白序列，并能地把SUMO從融合蛋白上切割下來。切除SUMO后，經過親和層析，去除標簽蛋白部分，就得到和天然蛋白一樣的重組蛋白。所以SUMO標簽也常用于和其他標簽一起應用，作為特異酶切水解位點。

HA
HA標簽蛋白，一種抗體免疫共沉淀標簽，序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的紅細胞凝集素表面抗原決定簇，9個氨基酸，對外源靶蛋白的空間結構影響小, 容易構建成標簽蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗體檢測和ELISA檢測。

c-Myc
C-Myc標簽蛋白，是抗體免疫共沉淀標簽的一種，由11個氨基酸組成，標簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，這11個氨基酸作為抗原表位表達在不同的蛋白質框架中仍可識別其相應抗體。C-Myc tag已成功應用在 Western-blot雜交技術、免疫沉淀和流式細胞計量術中, 可用于檢測重組蛋白質在靶細胞中的表達。