病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移
對于難以采用脂質(zhì)體介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，則通常使用病毒載體。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染又稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)，它為難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型提供了一種方法，可用于蛋白質(zhì)過表達(dá)或抑制，是臨床研究中最常用的方法(Glover et al , 2005; Pfeifer and Verma, 2001)。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要優(yōu)點之一在于，該過程可以在活體內(nèi)(體內(nèi))或培養(yǎng)細(xì)胞中(體外)進(jìn)行，基因輸送效率達(dá)95–99%。

病毒載體的主要特點
病毒載體可根據(jù)其特定的應(yīng)用量身定制，但必須遵循下列主要特性。
? 安全性：病毒載體有時來源于病原性病毒，應(yīng)對其進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎棧共《静僮鞯娘L(fēng)險最小化。通常需要敲除對病毒復(fù)制至關(guān)重要的部分病毒基因組，使病毒感染細(xì)胞并導(dǎo)入病毒載體，但應(yīng)防止在無輔助病毒存在的情況下生成新的病毒粒子，提供缺失的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。但目前病毒載體使用的安全問題是插入突變，病毒DNA染色體異位整合會破壞腫瘤抑制基因的表達(dá)或激活原癌基因，從而引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化(Glover etal , 2005)。
? 低毒性：病毒載體應(yīng)盡量不對其感染的細(xì)胞的生理學(xué)造成影響。這對于需要體內(nèi)基因?qū)氲难芯坑绕渲匾驗槿绻d體被視為外來入侵者，則生物體將發(fā)揮免疫應(yīng)答作用(Nayak and Herzog, 2009)。
? 穩(wěn)定性：一些病毒具有遺傳不穩(wěn)定性，會迅速重排基因組。這會對使用病毒載體的操作的可預(yù)測性和可重復(fù)性產(chǎn)生不利影響。因此，通常避免使用不穩(wěn)定的載體。
? 細(xì)胞類型特異性：大部分病毒載體都可以感染很多細(xì)胞類型。但有時反之更好。可以修飾病毒受體，使病毒靶向特定種類的細(xì)胞。該病毒修飾方法稱為假型化。
? 選擇性：病毒載體應(yīng)包含選擇標(biāo)記物，如特定的抗生素抗性，從而可以分離出攝取了病毒載體的細(xì)胞。

常用病毒載體
腺病毒是具有廣泛細(xì)胞嗜性的DNA病毒，可以瞬時轉(zhuǎn)導(dǎo)幾乎所有哺乳動物細(xì)胞類型。腺病毒通過結(jié)合Coxsackie/腺病毒受體(CAR)進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)(Bergelson et al ,1997)。腺
病毒與CAR結(jié)合后，通過整合素介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被內(nèi)化，然后主動運輸至細(xì)胞核內(nèi)，其DNA可在細(xì)胞核內(nèi)游離表達(dá)(Hirata and Russell, 2000)。盡管腺病毒載體適用于多種
細(xì)胞類型的瞬時轉(zhuǎn)染，但對于一些難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系(如非分裂細(xì)胞)及穩(wěn)定表達(dá)應(yīng)用，則慢病毒。腺病毒的包裝容量為7–8 kb。
逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種正鏈RNA病毒，可以將基因組穩(wěn)定整合至宿主細(xì)胞染色體內(nèi)。當(dāng)病毒包被上具有廣泛嗜性的包膜，如水皰性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)，形成假型病毒，則這些病毒可以進(jìn)入幾乎所有哺乳動物細(xì)胞。但是，大部分逆轉(zhuǎn)錄病毒依靠細(xì)胞分裂過程中核膜的破裂感染細(xì)胞，因此需要細(xì)胞復(fù)制方可完成轉(zhuǎn)導(dǎo)。逆轉(zhuǎn)錄病毒的其他缺點包括可能引起插入突變并激活潛伏性疾病。與腺病毒類似，逆轉(zhuǎn)錄病毒可以攜帶約8kb的外源性基因。

慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的一個亞群；因此，它們可以整合至宿主細(xì)胞基因組中，實現(xiàn)穩(wěn)定、長期的表達(dá)(Anson, 2004)。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，慢病毒采用活化的細(xì)胞核輸送途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂、終末分化的細(xì)胞群體(如神經(jīng)細(xì)胞和造血細(xì)胞)，是一種用途更廣泛的工具。
腺相關(guān)病毒能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)各種分裂和非分裂細(xì)胞，但需要同時感染一種輔助病毒(如腺病毒)或皰疹病毒，在包裝細(xì)胞內(nèi)形成重組病毒粒子。這會導(dǎo)致難以獲得不含輔助病毒的高質(zhì)量病毒儲液。此外，腺相關(guān)病毒的更大包裝容量僅為4 9 kb。另一方面，腺相關(guān)病毒在大多數(shù)細(xì)胞類型中具有低免疫原性，且能夠整合至人染色體的特定區(qū)域內(nèi)，從而避免了插入突變。
適用于蛋白質(zhì)過表達(dá)的其他病毒載體系統(tǒng)包括桿狀病毒、牛痘病毒和單純皰疹病毒載體。桿狀病毒一般感染昆蟲細(xì)胞，重組桿狀病毒可以作為基因轉(zhuǎn)移載體，在各種哺乳動物細(xì)胞中用于重組蛋白的瞬時表達(dá)。此外，桿狀病毒載體中還包含顯性選擇標(biāo)記物，從而可以提取出穩(wěn)定表達(dá)重組基因的細(xì)胞系(Condreay et al , 1999)。利用牛痘病毒載體可以將較大的DNA片段導(dǎo)入各種哺乳動物細(xì)胞中。但是，感染牛痘病毒的細(xì)胞會在一或兩天內(nèi)死亡，因此該系統(tǒng)僅限用于瞬時蛋白生產(chǎn)。單純皰疹病毒是一類可用于神經(jīng)元感染的雙鏈DNA病毒。

常用的報告基因
可誘導(dǎo)可鑒別特性的常用報告基因通常包含熒光和化學(xué)發(fā)光蛋白。
表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的細(xì)胞可在LUYOR-3410紫外光照射下發(fā)出綠色熒光。需要采用專門的顯微鏡觀察單個細(xì)胞。此外還有黃色和紅色熒光蛋白可供選擇，一次可以檢測多個基因。它常用于檢測基因表達(dá)。
熒光素酶用作實驗試劑時通常是指北美螢火蟲熒光素酶，盡管還有來源于其他種屬的螢火蟲的重組熒光素酶產(chǎn)品可供選擇。熒光素酶可以催化其底物(一般為熒光素)，根據(jù)熒光素酶基因的不同，產(chǎn)生黃綠色或藍(lán)色熒光。由于熒光素酶的生物發(fā)光無需激發(fā)光，因此幾乎不會出現(xiàn)自發(fā)熒光，可以實現(xiàn)無本底熒光。
GUS分析(使用β-葡萄糖苷酸酶)是一種的單細(xì)胞檢測方法，無需復(fù)雜設(shè)備可將細(xì)胞染成藍(lán)色。其缺點是細(xì)胞會在此過程中死亡。它常用于植物科學(xué)。
藍(lán)-白斑菌落篩選可用于細(xì)菌和真核細(xì)胞。細(xì)菌lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶。加入含有特定半乳糖苷(如X-gal)的培養(yǎng)基后，表達(dá)基因的細(xì)胞將X-gal轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，通過裸眼即可觀察。

常用RNAi術(shù)語表
RNAi：核糖核酸干擾 (A Fire and C Mello et al , 1998中使用)。
siRNA：短片段干擾RNA。siRNA是21–25 bp帶有二核苷酸3’突出端的dsRNA，在RNA干擾通路中，在Dicer的作用下由較長的dsRNA加工而來。導(dǎo)入合成siRNA可以誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞的RNAi。siRNA還可來源于內(nèi)源性前體。
shRNA“”短發(fā)夾RNA；又稱為短干擾發(fā)夾。可以采用基于載體的shRNA將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，實現(xiàn)穩(wěn)定的基因沉默。采用Pol III型強啟動子控制靶序列的轉(zhuǎn)錄，形成長度可變的發(fā)夾和莖環(huán)結(jié)構(gòu)，然后通過細(xì)胞siRNA機制進(jìn)行處理。shRNA一旦進(jìn)入細(xì)胞，可以通過RNAi下調(diào)具有互補序列的基因的表達(dá)。
miR RNAi：表達(dá)microRNA的載體，用于RNAi。miRNA是19–23 nt的單鏈RNA，來源于單鏈前體轉(zhuǎn)錄本，它含有堿基配對不的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。miRNA在沉默復(fù)合物中的功能與RISC類似。
化學(xué)修飾的siRNA：具有化學(xué)修飾的siRNA分子。
RISC：RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)。由蛋白質(zhì)和siRNA組成的核酸酶復(fù)合物，可以靶向并剪切與RISC復(fù)合物中siRNA互補的內(nèi)源性mRNA。
脫靶效應(yīng)：導(dǎo)入siRNA或d-siRNA庫后，一個或多個非靶向基因出現(xiàn)基因功能喪失的現(xiàn)象。該效應(yīng)可能由siRNA的正義鏈介導(dǎo)，它可以啟動不相關(guān)基因出現(xiàn)功能喪失。脫靶效應(yīng)也可以是特定siRNA的反義鏈引起的二級效應(yīng)，它與非靶向基因具有足夠的同源性，抑制了該基因的表達(dá)。