點亮希望之光——綠色熒光蛋白的發現和發展

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是一種在當今生命科學和醫學研究中被廣泛使用的示蹤物。它的出現徹底改變了科研人員的實驗策略，基于GFP的光學成像技術使人們可以直接觀察到從微觀到宏觀各個層次上豐富多彩的生命現象。因在發現和研究綠色熒光蛋白方面作出杰出貢獻，下村修(Osamu Shimomura)、馬丁·查爾菲(Martin Charfie)與錢永健(Roger Tsien)分享了2008年的諾貝爾化學獎。細細品味GFP的發現與發展，筆者深切地感受到這個過程可以與任意一部好萊塢大片相媲美，開篇充滿驚險，中間出現驚奇，結尾一馬平川。雖然之前已經有一些同樣話題的文章，但是筆者依然想拋開晦澀的科學細節，用更加通俗的語言來與大家分享這一切，希望大家能從中感受到科學發現過程中的驚喜與快樂。

綠色熒光蛋白的發現——來自大海母親的意外禮物

生命源自大海。即便在現代科學如此發達的今天，大海仍是未知的世界。相信廣大讀者和筆者一樣，都從火爆異常的《少年派的奇幻漂流》中領略了大海令人恐怖的瘋狂和叫人窒息的美麗。筆者深深地記得影片中一個異常美麗的鏡頭，少年派和理查德-帕克漂浮在黑夜平靜的海面上，海水清澈的跟透明一般；海里漂浮著綠色的亮點，像無數飛舞在寂靜夜空中的孔明燈；突然一只巨大的鯨魚沖出水面，把平靜的海面打碎，派也被掀翻到海里。在這個迷人的場景中，綠色的亮點是一種水母， 大海母親送給人類的禮物——綠色熒光蛋白，就是在它體內發現的。

萬事開頭難，越是偉大的發現越是會有艱難的開始，在其中又會有很多讓人揪心的偶然因素，所以在后人看來，只要這些關鍵節點發生的事情稍微偏差一點點，一切都會是另一番景象。綠色熒光蛋白的發現也是這樣一個讓人"揪心"的過程。下村修是一名日本科學家，他從小跟隨非常傳統的爺爺奶奶生活。作為長子長孫，他被視為家族繼承人， 一言一行都會受到奶奶的嚴格要求，因此養成了良好的生活習慣。16歲那年，他親眼目睹了轟炸機掠過長崎，投下原子彈后離去，留下了劇烈爆炸后的火光和強烈沖擊波。幸運的是，下村修健康地活了下來。從小養成的良好生活習慣和二戰中對于生死的強烈體驗對下村修的秉性產生了巨大影響，使他具有堅韌不拔、百折不撓的性格和勇氣，這些都是進行開創性研究必備的品格。另外，下村修從小家境殷實，這讓他躲過了戰時和戰后的蕭條期，有物質條件繼續學習和深造。

經歷了轟炸的長崎百廢待興，二戰結束兩年之后，下村修才勉強進入了一所當地的醫學院(Nagasaki Phamacy College)開始學習。四年之后(1951年)他以優異的成績完成了本科學業，留在了安永(Yasunaga)教授的實驗室從事物質純化和層析分析方面的研究。工作四年之后，安永教授決定推薦下村修到名古屋大學(Nagoya University)江上修(Igami)教授的實驗室從事當年異常火爆的分子生物學研究。遺憾的是，江上修教授外出不在。不幸中的萬幸，下村修得到了平田義正(Yoshimasa Hirata)教授的邀請，到平田教授的實驗室工作。之后也正是因為在平田教授實驗室的工作，他走上了GFP的發現之路(好險！讓人揪心)。

在那個物理學家紛紛轉投生物學的年代，人們對于了解生物現象的物理學基礎非常感興趣，解析各種物質的結構是大家都非常關心的話題。平田教授給了下村修一個極具挑戰性的課題：為解析大名鼎鼎的熒光素(luciferin)發光原理做好基礎性工作——純化并結晶熒光素。經過很長時間的艱苦實驗，下村修依然一無所獲。一次深夜加班之后，他決定暫時放棄原來的實驗計劃，將不用的樣品用做另一種分析。因為已是深夜，加好初步的試劑之后，下村修未對樣品進行進一步處理就回家休息了。令人驚奇的是，第二天回到實驗室，他發現試管里的熒光素結晶出來了。這不經意"偷懶"帶來的成功(好讓人揪心)，與費萊明發現青霉素的經歷何其相似，機會真的是垂青有準備的人。

有了這樣出色的研究經歷，下村修收到了普林斯頓大學約翰遜(Frank H. Johnson)教授的邀請，進入這座聞名遐邇的學府，開展對水母發光機制的研究。他最初的研究集中在水母的另外一個熒光蛋白上。在那個年代，人們普遍認為生物熒光的物質基礎都類似于熒光素，并非蛋白質，所以下村修和他導師開始的研究思路并沒有集中在蛋白質上。經歷了一系列失敗之后，下村修決定跳出熒光素的思維，從蛋白質的角度來開展實驗，這與他導師的研究思路產生了嚴重分歧。但下村修決定堅持下來，他開展了卓有成效的實驗驗證了自己的觀點。

確定了這一點，下面的研究就圍繞這一思路展開。水母是海洋生物，所以在接下來的整個夏天，下村修所在實驗室的大部分精力都集中在出海收集水母、解剖和保存水母發光器官上。或許在常人看來，吹著海風，漫步海邊的生活非常愜意，但現實卻并非這般浪漫，日復一日的重復勞動是極考驗人的一件事。在這樣的堅持下，上帝又一次眷顧了下村修和他的同事。一次深夜，下村修將裝有廢棄樣本的管子扔到了盥洗池，盥洗池里的海水倒灌進了管子，他驚奇地看到倒灌的海水使管子里的樣本發出了熒光。這個意外的現象使得他發現，這種熒光蛋白是鈣離子敏感的，這也直接導致了它在接下來細胞功能成像中的大范圍應用，它就是大名鼎鼎的水母光蛋白aequorin。

在分離并純化aequorin之后，下村修對它的結構和發光特性進行了仔細的研究，意外發現純化的aequorin發出藍色光，但水母在自然條件下發出的卻是綠色熒光。下村修和他的同事推測在水母中存在另外一種綠色熒光蛋白，這種綠色熒光蛋白將aequorin發出的藍光進行了過濾，從而使水母發出綠色光。后來的實驗證明了這點，下村修成功分離了這種蛋白質，并稱之為綠色蛋白(green protein)，這就是之后大名鼎鼎的GFP；在這個基礎上，下村修更進一步地對GFP的發光機理進行了初步研究，這也為后來人們對綠色熒光蛋白發光機理的全面理解夯下了堅實的基礎。

之后的研究發現，GFP和aequorin在水母的發光器里發生了熒光共振轉移(fluoroscence resonance energy transfer)的物理反應，GFP吸收了aequorin發出的藍色熒光，發射出綠色熒光。下村修原本是想研究aequorin，但卻找到了為生命科學帶來革命性進步的GFP。這真是"山窮水盡疑無路，柳暗花明又一村"！當然，機會總是垂青有準備的頭腦，在這激動人心的發現背后，是下村修和同事們扎實而勤奮不懈的工作、熟練的技術以及對生物熒光現象真正的科學興趣。在這一過程中，他們收集的水母標本數以百萬計。令人感嘆的是，由于氣候和環境的變化，在當年下村修們收集水母的地方已經很難看到如此多的實驗標本了；如果下村修晚生十年，GFP的秘密就會被永遠埋藏在浩瀚的太平洋。

原來世間真的有掃地僧——被諾獎遺忘的巴士司機

當時研究生物學現象，都是先收集大量實驗材料，經復雜處理后，以化學分析的方法來觀察和定量所關心的生物分子。這種方法完全失去了所研究生物分子在時間與空間上的特性，使"生物"變成"死物"，且帶來了極大的工作量。GFP的運用徹底改變了這一點。在下村修工作的基礎上，普瑞澤(Douglas C. Prasher)在博士研究生階段找到并克隆了編碼aequorin的基因。之后他在伍茲霍爾海洋研究所建立了自己的實驗室，繼續從事對生物熒光現象的研究。GFP被發現之后，普瑞澤更先意識到可以通過基因工程的方法將這種熒光蛋白連接到細胞內的各種分子上，讓這些分子帶上熒光尾巴，再通過光學成像對它們進行觀察和定量分析，同時研究它們在時間與空間上的特性；在另一個層次上，也可以將GFP表達在特定的細胞中，通過成像的方法來觀察這些細胞的運動和行為。這是一個在現在人人都知道的實驗策略，但在當時卻是一個革命性的想法。

1988年，普瑞澤從美國癌癥學會申請到為期兩年的研究經費，用于尋找并克隆編碼GFP的DNA序列。在那一個基因一個博士學位(one gene, one PhD)的年代，克隆一個基因并不如現在這么容易。經過了長期的實驗，普瑞澤最終成功克隆了這個基因。但遺憾的是，兩年后他沒有申請到別的研究經費，無法就GFP能否通過基因工程在其他生物細胞內表達開展進一步研究，他不得不關閉自己的實驗室另謀生路。輾轉幾年后，他成了一名巴士司機，時薪不到10美元。這樣，GFP在水母之外的生物中是否能夠發光的研究停止了下來。雖然如此，普瑞澤依然和眾多科研人員分享了他克隆出的DNA，這包括之后獲得諾貝爾化學獎的馬丁·查爾菲與錢永健。普瑞澤的這一貢獻為后來GFP的廣泛運用鋪下了塊基石。雖然沒有得到諾貝爾獎委員會的認可，但是在談到普瑞澤的貢獻時，馬丁·查爾菲甚至說："他們可以忽略掉我，把這個獎頒給普瑞澤。"普瑞澤也獲得了馬丁·查爾菲和錢永健的邀請出席諾貝爾獎頒獎儀式。雖然有著掃地僧般的名望，但現實并不像武俠小說那樣瀟灑；由于沒有穩定的工作，普瑞澤一直過得很辛苦，為了生存而奔波。在窮困潦倒之后，普瑞澤又回到了科研領域，在錢永健的實驗室任職，繼續發揮他的天賦。

個吃螃蟹的人——勇氣和運氣真的很重要

在成功克隆GFP的基因之后，人們順理成章地想到該如何使用這樣一個熒光標記工具。但在當時有一個問題一直困擾著人們——GFP最終發出熒光是否需要經過水母體內特殊物質的加工？如果這種物質在其他物種中不存在，那么即便GFP成功表達了，它也不能發出熒光，通過熒光標記觀察生物學過程就成了空談。也正是因為這個原因，普瑞澤將他克隆出的GFP稱為"綠色熒光蛋白前體"，意指這種蛋白質還需要未知物質的加工才能發出熒光。在這個大家都疑惑的時候，個成功吃到螃蟹的人出現了，他就是馬丁·查爾菲。馬丁·查爾菲師從大名鼎鼎的西德尼-本瑞納(Sydney Brenner)。在生物學領域，本瑞納是一位尚在世間德高望重的老科學家，他經歷了沃森-克里克解析DNA結構那個火紅的年代，因為在線蟲領域開創性的工作獲得了諾貝爾獎；在果蠅中他也做出了很多先驅性的工作，他是生物學領域里的"張三豐"。

名師出高徒，師從這樣一位具有強大開創精神的導師，查爾菲也是一個敢于吃螃蟹的勇士。他當時是哥倫比亞大學的生物學教授，主要從事生物如何通過觸覺感知外部世界的研究。1988年，他在學校參加一個關于生物發光的研討會，在研討會上，有人介紹了水母的發光機制和GFP在其中的作用。與普瑞澤類似，查爾菲同樣意識到可以運用GFP來標記細胞并觀察生物學現象，比如在線蟲這種通體透明的小蟲中觀察基因的表達情況。在接下來的幾天里，查爾菲查找了大量資料試圖找到是否有人克隆了GFP的基因；他發現普瑞澤正在嘗試做這件事情。與普瑞澤聯系并交換想法之后，他們一拍即合，計劃將GFP表達在線蟲的細胞里。可惜的是當時普瑞澤并沒有完成對GFP整個基因的克隆，他只得到了部分的區段。讓人流汗的劇情在這個時候出現了：四年過去，普瑞澤成功克隆了全長的GFP基因，他試圖聯系查爾菲；遺憾的是查爾菲當時外出度假了，沒有人告訴普瑞澤如何找到查爾菲，普瑞澤只好作罷。

幸運的是，在線蟲中表達GFP這個想法一直留存在查爾菲腦海中。1992年，研究生一年級的GhiaEuschirken來到了查爾菲的實驗室，查爾菲跟她談了在線蟲中表達GFP的想法；他們立刻去圖書館查找文獻，想看看是否有新的關于GFP的工作。他們驚喜地發現，普瑞澤已經成功克隆了全長的GFP基因。查爾菲立刻撥通了普瑞澤的電話，在電話中普瑞澤告訴查爾菲，他初步嘗試了表達GFP，但表達之后卻沒有看到熒光，有可能水母中有特殊的物質， GFP需要被這種物質加工之后才能發出熒光。雖然如此，查爾菲依然決定再試一試。于是普瑞澤將GFP的基因郵寄給了查爾菲，之后查爾菲指導GhiaEuschirken將GFP表達在大腸桿菌內；他們幸運地發現表達GFP的大腸桿菌發出了綠色熒光：原來GFP并不需要與水母中特殊的物質相互作用就能發出熒光！之后查爾菲將GFP表達在了線蟲中，他也在線蟲中觀察到了熒光。這個工作發表在Science雜志上，成為了分子生物學與遺傳學領域劃時代的工作。

在談到這段經歷時，查爾菲感慨道"基因表達有很多標準策略，我們僅僅是運用了其中一種；也許對GFP來說，其他的標準策略都不能實現正常的表達。我們很幸運地成功了。"在別人失敗之后，查爾菲依然嘗試新事物的勇氣和采用合適方法的幸運為他帶來了諾貝爾獎。查爾菲成功在線蟲表達GFP之后，無數的研究者開始跟他聯系索取GFP的基因序列，在自己的實驗系統里開展實驗。GFP引領的生物學革命來臨了！

織出生物學天空最美麗的彩虹——巧手奪天工的錢氏后人

山雨欲來風滿樓，雖然GFP引領的生物學革命已經初現端倪，但GFP本身還不夠，還在等著后來者對它做出進一步的改造；它就像一塊璞玉，需要富有想象力的能工巧匠來打磨。華裔科學家錢永健(Roger Tsien)就是這樣一個巧手奪天工的匠人。錢永健出生在一個工程師家庭，祖籍浙江杭州，用他自己的話說，他出生在一個"書香門第"。他的父親是一個無名但學識頗高機械工程師，他的兄長是生物學領域的大牛，他的堂叔錢學森，絕大多數人都耳熟能詳了。

作為一個跨領域、對改造分子情有獨鐘的"化學家"，在接觸GFP之前錢永健就對運用顯微鏡技術觀察生物學現象異常感興趣。他在20世紀70年代讀博士時，就設計合成了可以用光學成像來觀察細胞內鈣離子濃度的化合物BAPTA，這個化合物到今天仍然被廣泛運用。他最初接觸到GFP的來龍去脈筆者已無從了解，但在GFP被普瑞澤成功克隆的第二年(1994年)，錢永健就通過實驗，解決了人們關于為何GFP在大部分生物中都能發出熒光的疑惑：他發現氧分子就是那個人們一直猜測，參與GFP加工的因子。氧分子的廣泛存在使GFP可以在絕大多數生物體中形成成熟的發光基團并發出熒光。在這之后，錢永健領導的團隊更加細致地解析了GFP發光的原理，人們也破解了GFP的晶體結構。

有了原始GFP這塊璞玉和對它加工成熟與分子結構的認識，錢永健運用巧奪天工的設計開始了對GFP的改造。他在GFP的蛋白序列中引入突變，從發光顏色、成熟速度、發光亮度以及發光的穩定性方面對原始GFP進行了大規模的改造，讓它成熟更快，發光更亮，更適合在活體生物上工作；他們還開發出了青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白。在俄國科學院生物有機化學研究所Sergey A. Lukyanov中發現紅色熒光蛋白之后，錢永健又對原始的紅色熒光蛋白進行了改造，使它更加適合充當標記生物現象的工具。至此，可以發出不同顏色光的熒光蛋白們正式亮相，人們可以隨心所欲地以赤橙黃綠藍靛紫來標記并觀察各個層次的生命現象。錢永健用他的巧手織出了生物學界最美麗的彩虹，真正拉開了生物學革命的大幕。這也為他帶來了一個諾貝爾化學獎。

小小的羽毛一樣可以讓你飛得很高

在巧手的工匠面前沒有東西是的，他們總是有無盡的激情與想法來打磨手中的器物，創造出在常人眼中不可思議卻又異常好用的東西。GFP的發現和發展歷程帶給人們的不僅僅是GFP工具本身，它在方法和思路上帶來的影響更為深遠。在方法上，GFP誘發的革命直接帶動了光學成像技術在生命科學研究中的廣泛運用和飛速進步。現在人們不僅可以通過GFP及其衍生物來觀察生物大分子的物理運動，還可以觀察到微觀粒子(如鈣離子)和生物大分子生物活性的動態特征。更加讓人興奮的是，人們已經可以通過熒光蛋白，用光學成像的方法來控制生物大分子的活性。在思路上，GFP也提示人們千萬不要忽略大自然中一些簡單而"低等"的事物，這些事物往往蘊含著強大而直接可被人所用的工具。只要興趣指引著我們用心去找，就會有驚喜的發現：近年來名聲大噪的光通道蛋白、可變色的熒光蛋白都是這一點的明證，它們同樣成為了科學家手中強有力的武器。從這些低等生物中發現的小東西，也許只是一片小小的羽毛，但是我們相信真的會有那么，人類的巧手可以把它們粘成巨大的翅膀，帶著人類在認識與改造自然的征途上一飛沖天！