綠色熒光蛋白GFP

綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein，簡(jiǎn)稱GFP）是在美國(guó)西北海岸所盛產(chǎn)的一種名為Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)的一種可以發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)。GFP最早是在1962年由日本科學(xué)家下村修發(fā)現(xiàn)，是由238氨基酸組成的單體蛋白質(zhì)，蛋白分子量約為27kD。GFP的晶體結(jié)構(gòu)顯示，蛋白質(zhì)中央是一個(gè)圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)420nm，寬240nm，由11個(gè)圍繞中心α螺旋的反平行β折疊組成，桶的頂部由3個(gè)短的垂直片段覆蓋，底部由一個(gè)短的垂直片段覆蓋，對(duì)熒光活性很重要的生色團(tuán)則位于桶的大空腔內(nèi)。實(shí)驗(yàn)表明GFP熒光產(chǎn)生的前提是桶狀結(jié)構(gòu)完整性，去除N端6個(gè)氨基酸或C端9個(gè)氨基酸，GFP均會(huì)失去熒光。原因是GFP生色團(tuán)的形成效率較低，而且形成過程受外界環(huán)境影響較大。

綠色熒光蛋白發(fā)光原理：

綠色熒光蛋白GFP的第65至67位的三個(gè)氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸）殘基，可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團(tuán)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)鏈折疊時(shí)，這段被深埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸片段，得以“親密接觸”，導(dǎo)致經(jīng)環(huán)化形成咪唑酮，并發(fā)生脫水反應(yīng)。在分子氧存在的條件下，發(fā)色團(tuán)可進(jìn)一步發(fā)生氧化脫氫，最終成熟，形成可發(fā)射熒光的形式。具體過程為：在 O2存在下，GFP分子內(nèi)第67位甘氨酸的酰胺對(duì)第65位絲氨酸的羧基進(jìn)行親核攻擊，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應(yīng)之后，導(dǎo)致芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合，并最終自發(fā)催化形成對(duì)羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色。

綠色熒光蛋白GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问剑坏┲匦卤┞对诳諝饣蜓鯕庵校珿FP熒光便立即得到恢復(fù)。一般來說弱還原劑并不會(huì)影響GFP熒光，中度氧化劑如生物材料的固定，脫水劑戊二酸或甲醛等對(duì)GFP熒光影響也不大。

綠色熒光蛋白發(fā)光特性：

GFP吸收的光譜更大峰值為395nm（紫外），并有一個(gè)峰值為470nm的副吸收峰（藍(lán)光）；發(fā)射光譜更大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder）。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發(fā)光對(duì)細(xì)胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。此外，GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）很相似，兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強(qiáng)，特別是在450～490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強(qiáng)，因此更適用于定量測(cè)定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白，其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白無法比擬的。但因?yàn)镚FP不是酶，熒光信號(hào)沒有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白，比如螢火蟲熒光素酶等。

綠色熒光蛋白的應(yīng)用：

廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記，體內(nèi)示蹤，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，藥物篩選等生物科研的各個(gè)方面。

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上圖為海南大學(xué)用LUYOR-3415RG激發(fā)光源觀察葡萄愈傷組織的GFP熒光