轉基因動物
將外源性基因用實驗方法插入動物生殖細胞的基因組而獲得具有插入基因特性，并能正常繁衍的動物稱為轉基因動物 ( transgenicanimals)。轉基因技術是生物學領域最新重大進展之一，已能滲透到生物學、醫學、畜牧學等學科的廣泛領域。轉基因動物已成為探討基因調控機理、致癌基因作用和免疫系統反應的有力工具。同時人類遺傳病的轉基因動物模型的建立，為遺傳病的基因治療打下堅實的理論和實驗基礎。
轉基因技術涉及外源基因的組建、載體、受體、基因導入技術、供轉基因胚胎發育的體外培養系統和宿主動物等方面的內容。

一、轉移基因
(一)轉移基因的原理：轉基因技術的理論基礎在于各種生物的遺傳密碼都是統一的。都是以3個堿基決定一個氨基酸這樣的密碼形式貯存在DNA鏈上，各物種間形狀的不同僅僅是由于DNA上的四種核苷酸排列次序的不同，同時各種生物從DNA到蛋白質合成都服從“中心法則”,當一個物種的細胞內加入另一物種或人工合成的DNA(即基因)后就可能產生新的性狀。
(二)基因的獲得：取自現有的生物體如病毒、細菌、體細胞或腫瘤細胞的DNA,用限制內切酶或外切酶把DNA切割成若干小段,然后再把這些小段利用連接酶分別放入載體中,并建成載體克隆。載體通常是一種獨立的，能自我復制的遺傳物質，如質粒、某些噬菌體和病毒均可作為載體。基因的片斷可隨載體復制，有時亦可表達，用DNA 或抗體探針做分子雜交試驗或ELISA試驗篩選出帶有理想基因的克隆,再把理想基因載體放入大腸桿菌等宿主細胞中擴大、增殖,或采用PCR的方法擴增。再對擴增的DNA片斷進行適當修飾,例如將一個單一的基因與經選擇的啟動子重組合，然后進行轉移，或將特定的控制序列連接到目的基因的結構序列上，從而創造1個新的重組基因,然后再進行轉移。
理想基因也可用人工合成的辦法獲得，要合成一特定的基因，就是要合成具有一定排列順序的DNA，DNA上四種堿基的配對是非常嚴格的,腺嘌呤(A)必定和胸腺嘧啶(T) 配對，鳥嘌呤(G)必定和胞嘧啶(C)配對，由于蛋白質合成不是直接以DNA作為模板,而是以DNA的副本mRNA作為模板，在RNA中，用尿嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶(T)。

二、基因轉移的受體細胞
研究轉基因動物的制備，首先要考慮用何種轉基因受體細胞。選擇合適的受體細胞和可行的基因導入途徑，是該技術成功的前提。基因轉移的受體細胞必須是全能細胞，全能細胞隨著細胞分化、胚胎發育，可以把其中的基因組貯存的全部遺傳信息擴大到生物體所有的細胞中。除此以外至少是多能細胞。滿足轉基因動物需要的受體細胞有以下幾種。
(一)原生殖細胞：禽類的原生殖細胞容易分離、培養和冷凍，所以，這種受體細胞在禽類動物較易實現。
(二)配子：配子能把自身攜帶的基因組全部信息和外源插入基因序列，完整地貢獻給合子。由于精子可用作有效的轉移載體，所以，可以精子作為目的基因的受體。較多的是用重組病毒直接感染精子，精子即可把外源基因傳到合子。
(三)受精卵或胚胎內細胞團：精卵結合形成的單細胞受精卵，是最常用的外源基因轉移的受體；受精后的早期胚胎及囊胚期稍后的胚胎含有的內細胞團，該細胞團內含有未分化的胚胎干細胞，也可認為是全能的，或至少是多能性的，所以，用該時期的內細胞團或囊胚期的細胞作為外源基因的受體細胞，也可望達到基因轉移的目的。但這種情況下制備的轉基因動物多為嵌合體。

三、實驗動物的準備
本文主要敘述制備轉基因鼠的實驗程序。
(一)不育雄性公鼠:結扎公鼠與母鼠交配以后產生假孕母鼠。受結扎的公鼠需8周以上，對種系無特殊要求。在正式實驗前，結扎公鼠需與性成熟的雌性小鼠交配，反復交配兩次或三次，經檢查雌體有陰道栓，但均不懷孕產仔，則證明結扎成功。結扎公鼠使母鼠產生陰道栓的能力可維持2年。值得注意的是，如結扎公鼠與母鼠交配4～6 次均不能產生陰道栓，則該公鼠必須更換。
(二)假孕雌性母鼠:作為獲得外源基因即轉基因胚胎的養母，要求6周齡至5 個月較合適，對種系無特殊要求。其生殖系統的生理狀態應與移進胚胎的發育階段同步化，從而為移植胚胎提供著床和繼續發育的生理條件。將選好的成年健康雌性個體與不育雄性個體進行交配，時間應與供體(取受精卵的雌體)同時進行。一般為下午4點鐘合籠,次日晨選有陰道栓的待用。
(三)取受精卵的雌性母鼠：如果無特殊遺傳背景的要求，一般用雜交F1受精卵較為理想。因雜交F1代胚胎的發育能力和對外環境的耐受能力都較強，有益于提高移植胚胎的出生率。在對遺傳背景有特殊要求的情況下，供卵母鼠需選擇種系，例如把一種鼠的等位基因轉移到另一種不同等位基因的種系，這種卵供體母鼠必須有特定的遺傳背景，因此需用純系鼠。在實際操作中，一般用4～6周母鼠作為超排卵供體，3～4周母鼠產卵更多但卵細胞膜脆性較大，在處理過程中易破裂，而6周以后母鼠產卵逐漸減少。
(四)與卵供體母鼠交配的正常公鼠：公鼠性成熟約在6～8周，不同種系有些區別。每個作超排卵的母鼠與一只公鼠交配，次日上午檢查是否有陰道栓并作記錄。如兩次以上都不能使母鼠有陰道栓，或總的陰道栓產生率低于60～80％，則需更換公鼠。

四、基因導入的方法
(一)顯微注射法：在顯微鏡下，可借助顯微操作儀，將毛細玻璃管直接插入受精卵的雄原核中(較大的原核),注入特定的外源基因,即為基因顯微注射法。下面把利用顯微注射法制備轉基因鼠的方法和步驟簡述如下。
1. 超數排卵(超排)與取卵
(1)超數排卵：在雌性動物發情周期的某一階段,用促性腺激素促使卵巢里大量卵泡成熟并排出，稱超數排卵。影響母鼠超排因素有母鼠的性成熟程度、營養、體重及母鼠種系。超排的更佳時間隨種系不同而異,一般在3～5周，超過6周超排卵數明顯減少。
在實際操作中常取4～6周齡的母鼠作超排卵供體，腹腔注射孕馬血清(PMS) 和人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導母鼠排卵。PMS模擬卵泡刺激素(FSH)作用，hCG模擬黃體生成素(LH)的作用。二者注射時間間隔為42～48h，排卵發生在注射hCG后10～13h,注射劑量為每鼠5～10u。為了實驗方便，常在下午注射PMS，隔日同一時間注射hCG，注射hCG 后每只母鼠置于一個單獨飼養的正常公鼠籠內，次日晨檢查陰道栓。
(2)取卵：用頸椎脫臼法處死有陰道栓的雌鼠，把完整的輸卵管帶一小段子宮剪下,置于PBS平衡鹽溶液中，在解剖鏡下找出輸卵管傘部，用帶4號針頭的注射器將受精卵沖出，立即將卵子換至新鮮培養液內洗滌3～4次即可用于顯微注射。
2. 注射外源DNA：顯微注射需用顯微操作儀，用來控制顯微持卵針和顯微注射針。持卵針是顯微注射時固定受精卵的細玻璃管，管口平滑，通過一注射器控制持卵針，使其吸住要進行注射的受精卵。用來注射外源DNA的細注射針管表面平滑，鋒利,便于注射時穿過透明帶、細胞膜等。取已制備好的受精卵細胞和外源DNA懸液,在倒置顯微鏡下做顯微注射。注射時先用持卵針吸住受精卵，再用注射針吸取外源DNA懸液,然后推動注射針，使其刺入受精卵的雄原核，將DNA注入。注射完畢，慢慢抽出注射針,將受精卵放入新的培養液中，使其恢復。一般50～80％的受精卵在顯微注射后仍保持健康。
3. 注射后受精卵(或胚胎)的移植：注射后單細胞至桑椹胚的卵(受精后0.5天到3.5天)移植至受孕后的0.5天的假孕鼠的輸卵管，輸卵管移植需用被透明帶包裹的卵。也可將注射有外源DNA的受精卵或桑椹胚體外培養至囊胚，再行移植。顯微注射后3.5天的囊胚移植至受孕后2.5天的假孕鼠子宮，子宮移植不需要有透明帶。
此法的優點是，在一定設備和經驗條件下，實驗過程大為簡化；任何DNA 順序都可直接導入原核內,導入的外源DNA在卵裂前與受體基因組整合,其缺點在于導入的外源DNA通常以多拷貝***的形式隨機地整合于受體基因組中，妨礙其表達的正常調節。
(二)逆轉錄病毒感染法：以逆轉錄病毒作載體， 把重組的逆轉錄病毒載體DNA包裝成高滴度病毒顆粒，感染發育早期的胚胎，將外源基因導入宿主的染色體內的方法稱為逆轉錄病毒感染法。此法操作簡單，可通過注射將重組病毒轉移到囊胚腔內，也可將去透明帶的胚胎與分泌重組病毒顆粒的細胞共培養，以達到將外源DNA 轉移到胚胎中去的目的。
這一方法的優點是，重組逆轉錄病毒可同時感染大量胚胎。感染后的整合率高；外源DNA在受體細胞基因組中的整合通常是單拷貝的；不需要昂貴的顯微注射設備。本法的缺點是，由于選用的受體是早期胚胎，不是受精卵，致使外源DNA 在動物各種組織中的分布不均,不易整合到生殖細胞中；由于病毒衣殼大小有限,限制了被導入的外源 DNA的大小，一般不超過15Kb。
(三)胚胎干細胞介導法：囊胚的內細胞團含有未分化的胚胎干細胞。體外建株的胚胎干細胞稱為EK細胞(embryonic karyotype cell)或(embryonic stem cell)。 如果將EK細胞移植到正常發育的囊胚腔中，它們能很快地與受體的內細胞團聚集在一起，參與正常的胚胎發育。用重組的逆轉錄病毒作為載體感染EK 細胞， 再將此EK細胞移植入受體囊胚腔，可發育成攜帶著特定外源DNA的個體。
采用這一方法的優點是，外源DNA的整合率高； 整合在生殖細胞中的比例也很高。缺點是，EK細胞株不易建立，長期培養后出現細胞分化現象；生產的轉基因動物都是嵌合體。
(四)精子載體法 將外源DNA與精子一起孵育，精子可捕獲外源DNA，并通過受精過程將外源DNA導入受精卵。此法不僅可免去復雜而昂貴的設備， 且可省去不少繁雜的操作和條件準備。但該法有些結果不能重復。
此外，還有一些其它的方法，都有不同的優缺點。

五、轉基因鼠的檢測
待假孕母鼠產出幼仔后,可用幼鼠尾巴提取DNA;對于一些基因調控研究,需要盡快獲得信息而暫不需保留轉基因鼠，從胎鼠組織或幼鼠尾巴提取的DNA,可用PCR、Dot blot
(斑點雜交)、Southern blot(Southern轉移)等多種方法分析以確定是否轉基因鼠。

六、基因轉移后的存在方式及表達
(一)外源基因導入后的存在方式：外源基因被導入受體細胞后，在受體細胞內的存在方式有三種：
1. 非同源重組。大多數外源基因導入受體細胞后,與受體細胞染色體的某一位點隨機整合，這樣可帶來正常基因的插入、缺失、易位等突變。
2. 同源重組。導入的外源DNA與受體細胞染色體的DNA 通過順序取代或順序插入實現同源重組。通過同源重組有可能導致受體細胞正常的基因發生突變，當然，也有可能代替原來的有遺傳缺陷的遺傳基因，從而糾正遺傳缺陷。
3. 游離存在。外源基因沒有整合到受體細胞中,而是以附加體的形式游離在受體細胞內，能自我復制，并能100％的傳給下一代。
(二)外源基因導入后的表達：外源基因導入受體細胞后能否表達，是受許多因素影響的。
1. 外源基因本身的結構和性質。
2. 附帶的原核載體順序。研究發現，原核載體的存在對α-甲胎蛋白、β- 珠蛋白等基因的表達具有明顯的抑制作用，而對免疫球蛋白和膠原蛋白基因的抑制不明顯。
3. 染色體位置。 外源基因在受體動物細胞染色體上整合部位的基因環境對外源基因表達的影響很大。
4. 甲基化。被轉移的基因容易甲基化而失活。
外源基因在受體細胞中的表達方式表現為組織特異性和發育階段特異性。組織特異性表達是由于某些調節元件如啟動子和增強子的作用造成的。比如，免疫球蛋白基因只在B細胞中表達，原因是免疫球蛋白基因的啟動子只存在于B淋巴細胞內，這是一類只在專一細胞中表達的啟動子；另有一類可在多種組織細胞中表達的啟動子，比如，人生長激素基因分別在肝與腎、淋巴器官和肌肉中表達。發育階段特異性表達是指轉基因在個體發育中的表達具有嚴格的時空特性，受到精細的調控。

實驗動物的正確選擇
實驗動物的選擇是醫學科學研究中首先要考慮的問題。因為實驗動物選擇恰當與否關系到課題質量的高低、經費開支的多少、研究途徑正確與否以及實驗方法 的簡單與繁瑣問題，甚至會影響到課題的成敗及研究結果正確性。因此，必須從觀念上將實驗動物的選擇看作科技項目立項查新的文獻檢索一樣，作為醫學科研工作中的一個有機組成部分。同時，必須從實驗動物學的學科高度給予足夠的重視。其次，要了解實驗動物學基本知識，這是正確選擇實驗動物的基本條件。

常用實驗動物：
袋鼠(有袋目)、犰狳(貧齒目)、刺猬(食蟲目)、蝙蝠(翼手目)、兔、鼠兔(兔形目)、大鼠、小鼠、地鼠、豚鼠(嚙齒目)、江豚(鯨目)、海狗(鰭足目)、馬、騾、驢(奇蹄目)、豬、牛、羊、鹿(偶蹄目)、狗、貓、鼬(食肉目) 、獼猴、黑猩猩(靈長目)等。

生物醫學實驗中選擇實驗動物的基本原則
1.選用與人的機能、代謝、機構和疾病特點相似的動物。
非人靈長類動物----進化程度更高，是最接近與人類的理想動物，如，獼猴。
其他動物----雖進化程度低些，但可以達到實驗目的，如，犬、貓、豬等。
2.選用解剖、生理特點符合實驗目的要求的實驗動物、充分利用不同品種品系實驗動物存在的某些特殊反應。
如:
開胸和心臟實驗----適宜選用兔做實驗；
發熱、解熱和檢查致熱源實驗-----適宜選用兔做實驗；

觀察藥物對排卵的影響，進行避孕藥
研究-----適宜選用兔、貓；
動脈粥樣硬化實驗-----適宜選用兔、豬、猴；
肝外科實驗研究------適宜選用大鼠；
膽囊功能研究------不能選用大鼠；
嘔吐實驗----適宜選用猴、貓；
變態反應、Vc缺乏癥研究----適宜選用豚鼠；
對帶有雌激素活性的藥物進行避孕藥效研究----不能選用小鼠、大鼠；
同品種不同品系的動物存在有很多特殊的反應，應注意選擇應用。

3.根據課題研究目的內容選用
相匹配的標準化動物
標準化動物系指，經遺傳學、微生物學、環境及營養控制而繁育的動物。
微生物學、環境及營養的控制才能排除動物因攜帶影響實驗結果的微生物、寄生蟲及潛在疾病對結果準確性的影響。
遺傳學的控制才能排除實驗動物因雜交、遺傳學污染而造成個體之間的差異，影響結果的可重復性。

實驗動物遺傳類別選擇
近交系----其動物遺傳的均質性保證了實驗反應的穩定性；
封閉群----能較好地代表自然群體的遺傳特性；
F1雜交群----在一定程度上，兼有近交系和封閉群的特點；
突變動物----往往具有鮮明的人類疾病模型特征。

實驗動物具體品種品系選擇
如果實驗結論只針對某一品系則使用一個品系；
如果實驗結論針對整個物種在內的一般性研究則使用多個不同來源的品種、品系。
一般對多物種進行實驗時，應先選小型動物，再推廣到大型物種；要求只能建立在對多個物種進行實驗的基礎上，才能推廣到人類，也稱動物實驗外推。常用順序時小鼠、大鼠、兔、犬、猴。

微生物級別選擇
普通級----一般為教學示范用；
清潔級----國內科研工作要求的標準動 物，適合于大多數科研課題；
SPF級----國際標準實驗動物；
無菌動物-----僅在特殊課題需要時使用。

4.選用與實驗要求相適應的實驗動物規格
年齡----年齡不同，其生物學特性往往不同，一般選性成熟后的青壯年動物。太小的動物的生理功能未達到成年水平。太老的動物的各器官老化，代謝功能下降，只在老年醫學研究中使用；
體重----在正常營養狀態和飼養條件下，體重與年齡有一定的相關性；
性別----許多實驗證明，同一品種（系）不同性別的動物對外界刺激的反應不一致。

5.選用人獸共患疾病的實驗動物和傳統應用的實驗動物
有些病因造成人和動物共同患病，其臨床過程、病理變化也相似，所以就應選用這樣的動物來研究人類疾病；
選擇科研、檢驗和生產中傳統使用的實驗動物。通過實踐積累，各個專業均會在某些方面的課題選定自己常用的動物品種系。

6.實驗動物的選擇和應用需注意符合相應的國際規范
國際上普遍要求動物實驗達到實驗室操作規范（GLP）和標準操作程序（SOP）。這些規范對實驗動物的選擇和應用、實驗室條件、工作人員素質、技術水平、操作方法都要求標準化。這是實驗動物選擇和應用的總的要求。
遵循國際上的3R規則-----減少動物用量、實驗要精細、盡量采用替代物。

傳出神經藥理學實驗中實驗動物的選擇
在測定新藥的急性毒性實驗（LD50）時，動物如出現豎毛，活動增加，激動興奮，以致發展為強直一陣攣性抽搐，可初步考慮為擬交感藥。進而可觀察其動物（或貓）血壓的反應，如興奮α-受體，則對血壓影響較大，并反射地使心率減慢，如興奮β受體，可見血壓下降和心率明顯增快。為了較確切地區分其對α、 β受體的作用，還可采用α受體阻斷藥酚妥拉明，β受體阻斷藥心得安等作為工具。除血壓實驗外，尚可采用貓瞬膜，貓（或狗）在體腸活動等實驗方法。利用一些 體外實驗可分析擬交感藥的作用部位，其中最敏感的實驗之一是大白鼠胃底條，此外有兔頭肌、離體兔耳、豚鼠氣管鏈、豚鼠回腸和雞盲腸等制備。可用已知的α或 β-受體興奮劑作為標準，觀察它們與α或β-受體阻斷藥的相互作用，而確定其作用部位。

乙酰膽鹼具有毒蕈堿樣及菸堿樣作用，前者可被阿托品阻斷，后者可被神經節阻滯藥及橫紋機松馳藥阻斷。凡是通過直接或間接作用興奮副交感效應點的藥物 可出現流淚、流涎、排尿和排便癥候群。因此在小白鼠LD50實驗中可獲得初步印象，進而分別觀察其對血壓、唾液、瞳孔及胃腸道等反應。在貓血壓實驗、蛙 心、蛙腹直肌、水蛭背肌等標本上可檢定擬膽堿藥和觀察抗膽堿藥的作用，亦可用整體實驗如抑制大白鼠胃潰瘍，抑制大白鼠腸內活性炭下移等方法觀察之。

消化道平滑肌實驗中實驗動物的選擇
多種動物的離體腸道可用來試驗傳出神經藥物，一般多用離體豚鼠及兔的腸道。豚鼠回腸的自發活動較少，描記時有穩定的基線，適合作藥物鑒定用。兔腸 （尤其空腸）具有規則的擺動運動，適用于觀察藥物對此動物的影響。豚鼠回腸標本加負荷后已完全松馳，因此加入擬交感藥不會使其更松馳。

離體豚鼠回腸可用于觀察乙酰膽堿（Ach）和擬膽堿藥的劑量－反應關系；可檢定Ach和擬膽堿藥的含量。離體兔空腸有節律性收縮活動，可觀察腎上腺 素（4μg）、去毒豆堿（2μg）等藥物對空腸擺動運動的影響。大白鼠胃底條是檢定兒茶酚胺類藥物和5-羥色胺（5-HT）最敏感的標本。主要觀察藥物對 胃縱行肌的作用，因標本中環形肌已切斷。經檢定兒茶酚胺對其敏感度要比大白鼠子宮標本大10～100倍。雞食道由副交感神經支配，因此離體雞食道標本適合 于試驗擬副交感藥物。由于其作用不能完全被神經節阻斷藥所阻滯，故不宜用于試驗作用于神經節的藥物。

心血管實驗中實驗動物的選擇
血壓實驗是檢驗傳出神經藥物極其敏感的方法，一般采用急性血壓實驗，動物中以狗、貓、兔和大白鼠常用。兔不適用于降壓實驗，因其易于死亡。實驗可用 麻醉或毀腦動物，因麻醉動物的血壓常有三級波動（級波動，又稱脈搏性波動，系每次心搏影響血壓所致，第二級波動，又稱呼吸性波動，即吸氣時，血壓微升，呼氣時血壓微降；第三級波動，系血管運動中樞以稍長間隔，興奮性周期性改變），使血壓升降不穩。如動物毀腦后，可排除脊髓以上的中樞神經神經對血壓的 影響，只出現級波動，血壓曲線極不平衡。
離體兔主動脈條實驗：兔主動脈上含有α-受體，它是測定作用于α-受體藥物的一個很好標本，已被廣泛用來鑒定和分析擬交感藥及其對抗藥的作用。兔主動脈制備曾試制過多種形式，如主動脈環、片及條狀等，但兔主動脈螺旋條是最合適的方法之一。此標本有較多優 點，如一個主動脈可制作3～4個標本，可供配對試驗，對低濃度擬交感藥就很敏感，組織穩定性好，可維持較長時間。

美國路陽生產有便攜式熒光蛋白激發光源，能夠方便快捷觀察到轉基因動物有沒有熒光蛋白表達，LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發光源能夠激發轉基因動物體內的熒光蛋白發出熒光，讓科研人員無需昂貴的動物成像設備，通過熒光蛋白觀察眼鏡直接觀察熒光蛋白的表達。目前，LUYOR-3415RG在中國很多高校的生命科學學院和醫院得到了科研人員的認可。